大鼠Agouti相關蛋白（AGRP）ELISA檢測試劑盒檢測原理

試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被大鼠Agouti相關蛋白（AGRP）捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經過溫育并*洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的大鼠Agouti相關蛋白（AGRP）呈正相關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度。

樣品收集、處理及保存方法

.  血清：使用不含熱原和內毒素的試管，操作過程中避免任何細胞刺激，收集血液后，3000轉離心0分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。

2.  血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉離心30分鐘取上清。

3.  細胞上清液：3000轉離心0分鐘去除顆粒和聚合物。

4.  組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉離心0分鐘取上清。

5.  保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

自備物品

酶標儀（450nm）
高精度加樣器及槍頭：0.5-0uL、2-20uL、20-200uL、200-000uL
37℃恒溫箱
操作注意事項

  試劑盒保存在2-8℃，使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會有結晶，這屬于正常現象，水浴加熱使結晶*溶解后再使用。
  實驗中不用的板條應立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。
  預處理后的樣本無需稀釋，直接取0μL加樣即可。
  嚴格按照說明書中標明的時間、加液量及順序進行溫育操作。
  所有液體組分使用前充分搖勻。
試劑盒組成

名稱

96孔配置

48孔配置

備注

微孔酶標板

2孔×8條

2孔×4條

無

標準品（32 ng/mL）

0.6mL

0.6mL

按說明書進行稀釋

標準品稀釋液

6mL

3mL

無

樣本稀釋液

6mL

3mL

無

大鼠Agouti相關蛋白（AGRP）ELISA檢測試劑盒檢測抗體-HRP

0mL

5mL

無

20×洗滌緩沖液

25mL

5mL

按說明書進行稀釋

底物A

6mL

3mL

無

底物B

6mL

3mL

無

終止液

6mL

3mL

無

封板膜

2張

2張

無

說明書

份

份

無

自封袋

個

個

無

注：標準品用標準品稀釋液依次稀釋為：32、6、8、4、2、 ng/mL.

試劑的準備

 20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按：20稀釋，即份的20×洗滌緩沖液加9份的蒸餾水。

洗板方法

  手工洗板：甩盡孔內液體，每孔加滿洗滌液，靜置min后甩盡孔內液體，在吸水紙上拍干，如此洗板5次。
  自動洗板機：每孔注入洗液350μL，浸泡min，洗板5次。
操作步驟

  從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
  設置標準品孔、樣本孔和空白孔，空白孔什么都不加；標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；
  待測樣本孔先加樣本稀釋液40μL，再加待測樣本0μL；
  隨后標準品孔和樣本孔中（空白孔不加）加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體00μL，，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
  棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）。
  所有孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育5min。
  所有孔加入終止液50μL，5min內，在450nm波長處測定各孔的OD值。
結果判斷

 繪制標準曲線：在Excel工作表中，以標準品濃度作橫坐標，對應OD值作縱坐標，繪制出標準品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值。

大鼠Agouti相關蛋白（AGRP）ELISA檢測試劑盒試劑盒性能

.  準確性：標準品線性回歸與預期濃度相關系數R值，大于等于0.9900。

2.  靈敏度：zui低檢測濃度小于0. ng/mL。

3.  特異性：不與其它可溶性結構類似物交叉反應。

4.  重復性：板內、板間變異系數均小于5%。

5.  貯藏：2-8℃，避光防潮保存。

6.  有效期：6個月