谷研試劑-常用蛋白質與非蛋白含氮化合物檢測項目（一）

一、體液總蛋白

體液總蛋白包括數量眾多的各種蛋白質，在進行定量測定時作了如下假定：①所有蛋白質都是單純的多肽鏈，糖脂類和金屬有機物等均不計在內，其含氮量平均為6％；②各種蛋白質理化性質雖不同，但與化學試劑的反應性一致。顯然，這過于理想化，因此任何一種化學方法測定體液總蛋白，均存在一定的缺陷。測定蛋白質一般利用蛋白質*的結構或

性質：①重復的肽鏈結構；②分子中均含有氮原子；③與色素結合的能力；④沉淀后借濁度或光折射測定；⑤和殘基對酚試劑反應或被紫外光吸收。臨床實驗室利用以上原理測定體液蛋白質的方法有多種，各種方法性能和應用情況不同，zui常用的是雙縮脲法，以下將重點介紹。

(一)雙縮脲法

【檢測原理】蛋白質中的兩個相鄰肽鍵(一CO—NH一)在堿性溶液中能與二價銅離子(Cu。’)作用產生穩定的紫紅色絡合物。此反應與雙縮脲(H：N—Oc—NH—CO—NH：，為兩個尿素分子縮合而成)在堿性溶液中與Cu。’作用形成紫紅色的反應相似，因此，將蛋白質與堿性銅反應的方法稱為雙縮脲法(biuret，．method)。

【參考區間】血漿總蛋白隨年齡增大有所增高，60歲后則稍有下降。新生兒為46～70g／L，數月齡到2歲為5～75g／L，3歲及以上為60~80g／L，成人為64～83g／L(直立行走)和60~78g／L(臥床)。

【臨床意義】血漿總蛋白濃度下降常由白蛋白濃度下降引起；濃度增高主要見于慢性炎癥等多克隆免疫球蛋白增多，以及漿細胞病的單克隆免疫球蛋白增多癥。

【評價】

·特異性 因至少含兩個…CO NH 基團才能與Cu。’絡合，故氨基酸及二肽無反應，三肽以上才能反應。體液小分子肽含量極低，對蛋白質來說可忽略不計。

2·呈色一致性 因呈色強度與肽鍵數量即蛋白質含量成正比，因此各種蛋白質呈色強度基本相同，在目前所有總蛋白測定方法中。

3·臨床應用 本法檢測范圍為0～20g／L，靈敏度不高，但很適合血清總蛋白濃度測定，絕大多數正常和病理血清總蛋白均在其檢測范圍內。雙縮脲法測定胸腹水總蛋白的檢測低限為0．47g／L，生物檢測限為．33g／L，胸腹腔積液總蛋白多數在4．5～50g／L，因此能采用該法測定。對蛋白質濃度很低的腦脊液和尿液，該法不是合適的定量方法。

(二)測定體液總蛋白的其他方法

·染料結合法在酸性環境下，蛋白質帶正電荷，可與染料陰離子反應而產生顏色改變，常用染料有氨基黑、麗春紅、考馬斯亮藍、鄰苯三酚紅鉬等。前兩種常作為血白蛋白電泳的染料?？捡R斯亮藍常用于需更高呈色靈敏度的蛋白電泳中，也可用于尿液、腦脊液等樣品的蛋白質定量測定，優點是簡便、快速、靈敏，但比色杯對染料有吸附作用，在自動生化分析儀中無法很好地清洗(手工清洗常采用乙醇)。染料結合法均存在不同蛋白質與染料結合力不一致的問題。

目前臨床上zui常用的是鄰苯三酚紅鉬(pyrogallol red molybdate，PRM)法。其原理是：在酸性介質中，鄰苯三酚紅一鉬酸鹽與樣品中的蛋白質形成復合物，使其zui大吸收峰從467nm轉移至594nm，在600nto處的吸光度與蛋白質濃度成正比。本法靈敏度高，檢測F限為lO~20mg／L，多數試劑盒的檢測上限約為2g／L。試劑不吸附比色杯，可用于自動生化分析儀中。不足之處仍然是試劑與各種蛋白質的呈色

2·凱氏定氮法(Kjeldahl method)該法于883年建立，是經典的蛋白質測定方法。其原理是：測定樣品中的含氮量，推算出樣品中的蛋白質含量。蛋白質中含氮量較為恒定，平均6％，即lg氮相當于6．25g蛋白質。含氮化合物用硫酸加熱分解，在有催化劑存在的條件下，生成硫酸銨，后者再與濃堿作用生成NH。OH，采用蒸餾法將氨蒸餾并被硼酸吸收，將硼酸銨用標準鹽酸滴定。根據標準鹽酸的消耗量可算出總氮量，再折算成蛋白質含量。該法定量準確性好，精密度高，靈敏度高，并適用于任何形態的樣品測定，至今仍被認為是測定許多生物樣品中蛋白質含量的參考方法。但該法操作復雜、費時，不適合臨床常規測定。樣品中各種蛋白質含氮量有少許差異，尤其在疾病狀態下差異可能更大。對于非蛋白含氮化合物較高的血清樣品，則還要測定無蛋白血濾液中非蛋白氮含量并將其扣除。

3·比濁法(turbidimetry) 某些酸如三氯乙酸、磺基水楊酸等能與蛋白質結合而產生微細沉淀，由此產生的懸浮液濁度大小與蛋白質的濃度成正比。該法的優點是操作簡便、靈敏度高，可用于測定尿液、腦脊液等蛋白質濃度較低的樣品；缺點是影響濁度大小的因素較多，包括加入試劑的手法、混勻技術、反應溫度等，且各種蛋白質形成的濁度亦有較大的差別。目前臨床上較多應用的是芐乙氯銨法，其原理是：芐乙氯銨在堿性條件下與蛋白質形成沉淀，其懸浮液穩定，可在660nm處進行濁度測定。該法是比濁法中較好的方法，其靈敏度、準確度以及對白蛋白和球蛋白的反應一致性都優于其他比濁法，檢測范圍較廣，可用于自動化分析，然而其精密度仍不夠理想。

4．酚試劑法(phenol reagent method) 由Folin于92年*，早期用于和測定，后由吳憲開始用于蛋白質定量。酚試劑法的原理是運用蛋白質中和使磷鎢酸和磷鉬酸還原為鎢藍和鉬藍。該法靈敏度較高。Lowry將酚試劑法進行了改良，先用堿性銅溶液與蛋白質反應，再將銅．肽鍵絡合物中的和與酚試劑反應，產生zui大吸收在745～750nm的顏色，使呈色靈敏度更為提高，達到雙縮脲法的00倍左右，有利于檢出較微量的蛋白質。各種蛋白質中和的含量不同，如白蛋白含0．2％，而球蛋白含2％～3％，因此本法不適合測定混合蛋白質，只適合測定單一蛋白質，如測定組織中某一蛋白質抽提物。該法易受還原性化合物的干擾，如帶一SH的化合物、糖類、酚類等。

5．直接紫外吸收法根據蛋白質分子在280nm或25／225nm的紫外吸光度值計算蛋白質含量。其原理是：芳香族氨基酸在280nm處有一吸收峰，可用于蛋白質的測定。因生物樣品常混有核酸，核酸zui大吸收峰為260nm，在280nm也有較強的光吸收，因而測得的蛋白質濃度可采用兩個波長的吸光度予以校正，即蛋白質濃度(g／I。)：．4：80nto。一0．74A：60nm。該法準確性受蛋白質分子中芳香族氨基酸的含量影響甚大，而且尿酸和在280nm附近有干擾，所以不適合血清、尿液等組成復雜的體液蛋白質測定，常用于較純的酶、免疫球蛋白等測定。本法不加任何試劑且不需要處理，可保留制劑的生物活性，可回收全部蛋白質。