谷研試劑-人類(lèi)免疫缺陷病毒抗體的ELISA測(cè)定

人類(lèi)免疫缺陷病毒抗體（抗-HIV）目前在臨床和血站實(shí)驗(yàn)室主要的檢測(cè)方法是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、膠體金或硒試紙條和免疫化學(xué)發(fā)光法，zui常用的是ELISA。ELISA測(cè)定現(xiàn)通常為采用手工操作或全自動(dòng)酶免疫分析儀的以微孔板條為固相的測(cè)定模式，測(cè)定操作非常簡(jiǎn)單，一般涉及到標(biāo)本的收集保存、試劑準(zhǔn)備、加樣、溫育、洗板、顯色、比色、結(jié)果判斷和結(jié)果報(bào)告及解釋等方面，其中任一環(huán)節(jié)的不當(dāng)都會(huì)影響測(cè)定結(jié)果，且尤以加樣、溫育和洗板等步驟為甚?，F(xiàn)分述如下。

 一、臨床標(biāo)本的收集和保存

  用于ELISA測(cè)定的臨床標(biāo)本zui為常用的是血清（漿），有時(shí)也用到唾液、尿液等標(biāo)本。影響抗-HIV ELISA測(cè)定的標(biāo)本因素包括標(biāo)本溶血、標(biāo)本被細(xì)菌污染、標(biāo)本貯存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)和標(biāo)本凝固不全等。
      ．標(biāo)本溶血 要注意避免出現(xiàn)嚴(yán)重溶血。血紅蛋白中含有血紅素基團(tuán)，其有類(lèi)似過(guò)氧化物的活性，因此，在以辣根過(guò)氧化物酶（HRP）為標(biāo)記酶的ELISA測(cè)定中，如血清標(biāo)本中血紅蛋白濃度較高，則其就很容易在溫育過(guò)程中吸附于固相，從而與后面加入的HRP底物反應(yīng)顯色。
      2．標(biāo)本被細(xì)菌污染 樣本的采集及血清分離中要注意盡量避免細(xì)菌污染。一則細(xì)菌的生長(zhǎng)，其所分泌的一些酶可能會(huì)對(duì)抗原抗體等蛋白產(chǎn)生分解作用；二則一些細(xì)菌的內(nèi)源性酶如大腸桿菌的β-半乳糖苷酶本身會(huì)對(duì)用相應(yīng)酶作標(biāo)記的測(cè)定方法產(chǎn)生非特異性干擾。
      3．標(biāo)本貯存時(shí)間過(guò)長(zhǎng) 標(biāo)本在2~8℃下保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，IgG可聚合成多聚體，在間接法ELISA測(cè)定中會(huì)導(dǎo)致本底過(guò)深、甚至造成假陽(yáng)性。血清標(biāo)本如是以無(wú)菌操作分離，則可以在2～8℃下保存一周，如為有菌操作，則建議冰凍保存。樣本的長(zhǎng)時(shí)間保存，應(yīng)在－70℃以下。
      4．標(biāo)本凝固不全 血液采集后，如收集管中無(wú)促凝劑和抗凝劑，則血液通常在半小時(shí)后開(kāi)始凝固，8~24h*凝固。日常檢驗(yàn)中，常在血液還未開(kāi)始凝固時(shí)即離心分離血清，此時(shí)因血液沒(méi)有*凝固，離出的“血清”并非為*的血清，其中仍殘留部分纖維蛋白原，如將其加入微孔中，在ELISA測(cè)定過(guò)程中仍可以形成肉眼可見(jiàn)的纖維蛋白塊，易造成假陽(yáng)性結(jié)果。因此，血液標(biāo)本采集后，應(yīng)使其充分凝固后再分離血清，或標(biāo)本采集時(shí)用帶分離膠的或于中加入適當(dāng)?shù)拇倌齽?br />      5．冰凍保存標(biāo)本避免反復(fù)凍融 冰凍保存的血清標(biāo)本須注意避免因停電等造成的反復(fù)凍融。標(biāo)本的反復(fù)凍融所產(chǎn)生的機(jī)械剪切力將對(duì)標(biāo)本中的蛋白等分子產(chǎn)生破壞作用，從而引起假陰性結(jié)果。此外，凍融標(biāo)本的混勻亦應(yīng)注意，不要進(jìn)行劇烈振蕩，反復(fù)顛倒混勻即可。此外，標(biāo)本在保存中如出現(xiàn)細(xì)菌污染所致的混濁或絮狀物時(shí)，應(yīng)離心沉淀后取上清檢測(cè)。

 二、試劑準(zhǔn)備

     在有些臨床實(shí)驗(yàn)室，對(duì)ELISA測(cè)定的試劑準(zhǔn)備有時(shí)比較隨意，較少有其可能會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的意識(shí)，通常的做法是，在實(shí)驗(yàn)時(shí)將試劑從冰箱中拿出來(lái)即用，而忽略了這種做法有可能影響后面溫育時(shí)間不夠的問(wèn)題，其直接的后果是對(duì)一些弱陽(yáng)性標(biāo)本的檢測(cè)出現(xiàn)假陰性。因此在ELISA測(cè)定中試劑的準(zhǔn)備zui為關(guān)鍵的是，在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將試劑盒先從冰箱中拿出來(lái)。在室溫下放置20分鐘以上后再進(jìn)行測(cè)定，以使試劑盒在使用前與室溫平衡。這樣做的目的主要是為了在后面的溫育反應(yīng)步驟中，能使反應(yīng)微孔內(nèi)的溫度能較快地達(dá)到所要求的37℃，以滿(mǎn)足測(cè)定要求。所以，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有保證室溫在一定范圍的措施和設(shè)施，如空調(diào)。并且這個(gè)范圍不宜過(guò)大，如可以定在23℃±2～3℃。其次，目前的商品ELISA試劑盒中的洗板液，均需在實(shí)驗(yàn)室使用時(shí)對(duì)所提供的濃縮液稀釋配制，因此稀釋時(shí)所用的蒸餾水或去離子水應(yīng)保證質(zhì)量。

 三、加血清標(biāo)本及反應(yīng)試劑

      在現(xiàn)在的ELISA商品試劑盒中，血清樣本的加入幾乎是*的要使用微量加樣器或全自動(dòng)加樣系統(tǒng)加入標(biāo)本的步驟。使用微量加樣器手工加樣必須注意的關(guān)鍵點(diǎn)是，加樣不可太快，要避免加在孔壁上部，不可濺出和產(chǎn)生氣泡。加樣太快，無(wú)法保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均一性。加在孔壁上部的非包被區(qū)，易導(dǎo)致非特異吸附。濺出會(huì)對(duì)鄰近孔產(chǎn)生污染，出現(xiàn)氣泡則反應(yīng)液界面有差異。試劑的加入在國(guó)產(chǎn)試劑盒中基本上均是從滴瓶中滴加，除了要注意滴加的角度外，滴加的速度也很重要。滴加太快，很容易出現(xiàn)重復(fù)滴加或加在兩孔之間的現(xiàn)象，這樣就會(huì)在孔內(nèi)的非包被區(qū)出現(xiàn)非特異吸附，從而引起非特異顯色。所以，有時(shí)候一份標(biāo)本用相同的試劑盒這次測(cè)定為陽(yáng)性，下次測(cè)定為陰性，往往就是上述加樣及試劑的錯(cuò)誤所致。在使用全自動(dòng)加樣系統(tǒng)加樣時(shí)，則必須為一次性吸頭，反復(fù)使用的鋼針，則會(huì)因?yàn)闃?biāo)本之間的交叉污染，而出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，在常規(guī)檢測(cè)中，表現(xiàn)為“拖帶”現(xiàn)象。

 四、溫育

     溫育是ELISA測(cè)定中影響測(cè)定成敗zui為關(guān)鍵的一個(gè)因素。ELISA作為一種固相免疫測(cè)定，抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)在固相上進(jìn)行，要使液相中的抗原或抗體與固相上的特異抗體或抗原*結(jié)合，必須在一定的溫度條件下反應(yīng)一定的時(shí)間。溫育所需時(shí)間與溫度成反比，即溫度越高，則所需時(shí)間相對(duì)較短。zui為常用的溫育溫度有37℃和室溫，其次是43℃和2～8℃。
      溫育這一步是臨床ELISA測(cè)定中zui容易出現(xiàn)問(wèn)題的步驟。通常目前國(guó)內(nèi)ELISA商品試劑盒的反應(yīng)溫育時(shí)間為37℃ 30分鐘～小時(shí)。一般來(lái)說(shuō)抗原抗體反應(yīng)在37℃下需要～2小時(shí)才能有較*的結(jié)合，低于小時(shí)，可能會(huì)影響測(cè)定下限。因此，關(guān)于溫育，在實(shí)際測(cè)定操作中一定要注意以下幾點(diǎn)：（）要保證在設(shè)定的溫度下有足夠的反應(yīng)時(shí)間：一般來(lái)說(shuō)，加完樣本和/或反應(yīng)試劑后，將微孔板從室溫拿至水浴箱或溫箱中時(shí)，孔內(nèi)溫度從室溫升至37℃，需要一定的時(shí)間，尤其是在室溫比較低以及非水浴的狀態(tài)下，這段升溫時(shí)間可能還比較長(zhǎng)；而在臨床實(shí)驗(yàn)室中，很少有人注意這個(gè)問(wèn)題，通常是將微孔板一放入溫箱即開(kāi)始計(jì)時(shí)，這樣就很容易造成在實(shí)際測(cè)定中溫育時(shí)間不夠，弱陽(yáng)性樣本測(cè)不出來(lái)的問(wèn)題；因此，為保證37℃下足夠的溫育時(shí)間，臨床實(shí)驗(yàn)室可自行確定本實(shí)驗(yàn)室不同季節(jié)（不同室溫下）微孔板從室溫拿至溫箱后需要多長(zhǎng)時(shí)間孔內(nèi)溫度才能達(dá)到37℃，從而適當(dāng)延長(zhǎng)板條在溫箱中的放置時(shí)間；具體的做法是，用一小溫度計(jì)放置板孔反應(yīng)溶液中測(cè)量觀(guān)察即可；（2）溫育溫度的選擇：在有的ELISA試劑盒的說(shuō)明書(shū)中，指出溫育溫度可有兩種，例如，一種是37℃下小時(shí)，另一種則為43℃下45分鐘；從免疫測(cè)定的抗原抗體反應(yīng)的本質(zhì)來(lái)看，在較低的溫度下反應(yīng)較長(zhǎng)的時(shí)間zui為*，如2～8℃下反應(yīng)24小時(shí)；較高的反
應(yīng)溫度，由于分子運(yùn)動(dòng)的加快，反應(yīng)時(shí)間縮短，這一點(diǎn)對(duì)分子含量較多的強(qiáng)陽(yáng)性樣本的測(cè)定沒(méi)有問(wèn)題，但對(duì)分子含量少的弱陽(yáng)性樣本則有漏檢的可能；因此，我們建議在臨床ELISA測(cè)定中盡量使用較低溫育溫度較長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間的條件；（3）“邊緣效應(yīng)”的排除：以前在使用96孔板的ELISA測(cè)定中，常發(fā)現(xiàn)有“邊緣效應(yīng)”，即外周孔顯色較中心孔深，產(chǎn)生這種“邊緣效應(yīng)”的原因可能為96孔板外周孔與中心孔表面或熱力學(xué)特征的不同，但有研究證實(shí)在溫育中的熱力學(xué)梯度可能是根本原因之所在。聚苯乙烯本身為不良熱導(dǎo)體，在實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)ELISA測(cè)定中，將板從室溫（通常在25℃左右）置于37℃溫箱，板孔升溫時(shí)，在外周孔與中心孔之間可能存在一熱力學(xué)梯度。因此使用水浴或在將反應(yīng)溶液加入至板孔中時(shí)，將板和溶液均加熱至溫育溫度（如37℃），就可以很容易地排除“邊緣效應(yīng)”，并且可提高測(cè)定的重復(fù)性。
      總而言之，在臨床ELISA測(cè)定中，要保證好的測(cè)定效果，可采用下述簡(jiǎn)單辦法來(lái)確保溫育條件，即盡量采用水浴，溫育中讓微孔板浮于水面上，或?qū)⒔杆纳巢挤湃胍淮箫埡兄谐梢粷窈校庞跍叵渲?，這樣就會(huì)因?yàn)榘鍡l孔底部直接與37℃水或濕布的接觸，以及水浴箱或濕盒內(nèi)的高溫度，而使反應(yīng)溶液的溫度迅速與溫室平衡。此外，采用微波或溫育時(shí)振蕩微孔板可提高溫育效率或縮短溫育時(shí)間。

 五、洗板
   固相免疫測(cè)定技術(shù)是一種非均相免疫測(cè)定技術(shù)，需以洗滌操作將特異結(jié)合于固相的抗原或抗體與反應(yīng)溫育過(guò)程中吸附的非特異成份分離開(kāi)來(lái)，以保證ELISA測(cè)定的特異性。因此，洗板對(duì)于ELISA測(cè)定來(lái)說(shuō)，也是極其關(guān)鍵的一步。以HRP作為標(biāo)記酶的ELISA試劑盒中使用的洗板液一般為含0.05% Tween20的中性PBS。Tween20為一種非離子去垢劑，既含親水基團(tuán)，也含疏水基團(tuán)，其在洗滌中的作用機(jī)理是，借助其疏水基團(tuán)與經(jīng)疏水性相互作用被動(dòng)吸附于聚苯乙烯固相上蛋白的疏水基團(tuán)形成疏水鍵，從而削弱蛋白與固相的吸附，同時(shí)在其親水基團(tuán)與液相中水分子的結(jié)合作用下，促使蛋白質(zhì)脫離固相而進(jìn)入液相，這樣就可達(dá)到去掉非特異吸附物的目的，但由于抗體或抗原的包被通常也是通過(guò)在堿性條件下與固相的疏水性相互作用而被動(dòng)吸附于固相，因此要注意非離子去垢劑的使用濃度。洗板液中Tween20濃度高于0.2%，可使包被于固相上的抗原或抗體解吸附而影響試驗(yàn)的測(cè)定下限。在臨床實(shí)驗(yàn)室中，ELISA測(cè)定的洗板一般有兩種方式，即手工和洗板機(jī)洗板。手工洗板即是在每次反應(yīng)溫育后，將反應(yīng)液吸出或甩干，然后在板孔中加滿(mǎn)洗液，放置2～3分鐘后，將洗液吸出或甩干，再在吸水紙上拍干。重復(fù)上述洗滌步驟3～4次，zui后在吸水紙上拍干，即可進(jìn)行下一步測(cè)定操作。洗板機(jī)洗板則是將上述手工操作改由洗板機(jī)進(jìn)行，使用洗板機(jī)洗板的一個(gè)特點(diǎn)是，每次洗板后不能拍干，故有較多的液體殘留，液體殘留量小的洗板機(jī)洗板至*所需的次數(shù)要少于殘留量大的洗板機(jī)。
      此外，在采用洗板機(jī)洗板時(shí)，洗板機(jī)的日常清潔維護(hù)、及時(shí)更換洗液和清潔洗液瓶，對(duì)于保證洗板質(zhì)量，避免“花板”非常重要。洗板機(jī)每次使用后，如不及時(shí)用蒸餾水*沖洗管道，則可能因?yàn)橄匆褐辛姿猁}緩沖液的殘留，一是導(dǎo)致管道堵塞，二是會(huì)利于細(xì)菌繁殖，導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。洗液更換不及時(shí)和洗液瓶清潔不到位，同樣會(huì)致洗液的細(xì)菌污染。

六、顯色

      在目前的以HRP作為標(biāo)記酶的商品抗-HIV/2 ELISA試劑盒中，均以四甲基聯(lián)苯胺（TMB）為底物，國(guó)產(chǎn)試劑提供的底物為A和B兩瓶應(yīng)用液；某些進(jìn)口試劑有可能為一瓶。一般商品試劑盒顯色反應(yīng)條件為37℃或室溫反應(yīng)5～30分鐘。從理論上說(shuō)，37℃30分鐘才可以使HRP的底物催化反應(yīng)*，盡管在zui初的0分鐘內(nèi)，絕大部份催化反應(yīng)即可完成。因此，為使弱陽(yáng)性樣本孔能有充分的顯色，建議在37℃下反應(yīng)25～30分鐘后，終止反應(yīng)比色測(cè)定。
      此外，在加入底物開(kāi)始顯色反應(yīng)前，是先檢查一下底物溶液的有效性，即可將A和B兩種液各加一滴于清潔的空板孔或eppendorf管中，觀(guān)察是否有顯色出現(xiàn)，如有，則說(shuō)明底物已變質(zhì)。以TMB為底物，整個(gè)顯色反應(yīng)過(guò)程無(wú)需避光。顯色反應(yīng)完成后，加入酸終止反應(yīng)，振蕩混勻后即可進(jìn)行下面的比色測(cè)定或肉眼判斷結(jié)果。

七、比色

    ELISA的比色測(cè)定由酶標(biāo)儀進(jìn)行。有的同行可能會(huì)認(rèn)為，既然由酶標(biāo)儀進(jìn)行，那么此時(shí)便可以萬(wàn)事大吉了。其實(shí)不然，因?yàn)楫?dāng)代較為先進(jìn)的酶標(biāo)儀，均有較多的功能，使用不當(dāng)，會(huì)得到令人難以理解的結(jié)果。如使用酶標(biāo)儀比色測(cè)定后，有許多的陰性測(cè)定孔的吸光度值為負(fù)數(shù)或測(cè)定假陽(yáng)性率大大增加等等。這主要是沒(méi)有正確地理解和使用酶標(biāo)儀所致。中檔以上的酶標(biāo)儀基本上都同時(shí)具有單波長(zhǎng)和雙波長(zhǎng)比色功能。所謂的單波長(zhǎng)比色即是通常的以對(duì)顯色具有zui大吸收的波長(zhǎng)如450nm進(jìn)行比色測(cè)定；而雙波長(zhǎng)雙色則酶標(biāo)儀在敏感波長(zhǎng)如450nm和非敏感波長(zhǎng)如630nm下各測(cè)定一次，敏感波長(zhǎng)下的吸光度測(cè)定值為樣本測(cè)定酶反應(yīng)特異顯色的吸光度與板孔上指紋、刮痕、灰塵等臟物所致的吸光度之和；非敏感波長(zhǎng)下測(cè)定即改變波長(zhǎng)至一定值，使得樣本測(cè)定酶反應(yīng)特異顯色的吸光度值為零，此時(shí)測(cè)得的吸光度即為臟物的吸光度值。zui后酶標(biāo)儀給出的數(shù)值為敏感波長(zhǎng)下的吸光度值與非敏感波長(zhǎng)下的吸光度值的差。因此，雙波長(zhǎng)比色測(cè)定具有能排除由微孔板本身、板孔內(nèi)標(biāo)本的非特異吸收、指紋、刮痕、灰塵等對(duì)特異顯色測(cè)定吸光度的影響的優(yōu)點(diǎn)，一般不必設(shè)空白孔（除非空白本身會(huì)產(chǎn)生顏色）。如在使用雙波長(zhǎng)比色時(shí)，仍設(shè)空白孔，就可能會(huì)造成前面提到的測(cè)定孔吸光度為負(fù)數(shù)的現(xiàn)象。由于ELISA測(cè)定中單個(gè)空白孔的非特異吸收具有一定程度的不確定性，也就是說(shuō)每次測(cè)定或同次測(cè)定空白孔位置的不同均有可能得到不同吸光度測(cè)定值，故而在ELISA測(cè)定比色時(shí)，是使用雙波長(zhǎng)比色。

八、結(jié)果判定
  臨床ELISA測(cè)定按其表示測(cè)定結(jié)果的方式分為定性和定量測(cè)定兩大類(lèi)。定性測(cè)定只是對(duì)標(biāo)本中是否含有待測(cè)抗原或抗體作出“有”或“無(wú)”的結(jié)論，分別用“反應(yīng)性”（reactive）或“陽(yáng)性反應(yīng)”和“非反應(yīng)性”（nonreactive）或“陰性反應(yīng)”來(lái)表示?？?HIV/2 ELISA檢測(cè)為定性測(cè)定，檢測(cè)的目的是判斷特定HIV感染的存在與否。ELISA定性測(cè)定的“反應(yīng)性”（reactive）或“陽(yáng)性反應(yīng)”和“非反應(yīng)性”（nonreactive）或“陰性反應(yīng)”的判定依據(jù)是試劑盒所確定的陽(yáng)性判
定值（Cut-off）。
     下面再解釋一下在ELISA定性測(cè)定結(jié)果判定中常用的一些縮寫(xiě)。（）S/CO：其中S為Sample（樣本）或Specimen（標(biāo)本）的簡(jiǎn)寫(xiě)，表示的是標(biāo)本測(cè)定的吸光度值，CO為Cut-off值的簡(jiǎn)寫(xiě)。除競(jìng)爭(zhēng)抑制法外，其它ELISA定性測(cè)定模式中，當(dāng)S/CO值大于或等于時(shí)，標(biāo)本的測(cè)定為“陽(yáng)性反應(yīng)”，小于時(shí)為“陰性反應(yīng)”。（2）S/N或P/N：其中S同（），N為Negative（陰性對(duì)照）的簡(jiǎn)寫(xiě)，P為Patient（患者）的簡(jiǎn)寫(xiě)。較早的試劑盒很多都使用S/N或P/N≥2.為陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)仍有一些試劑盒使用這種方式。這種方式與S/CO方式無(wú)根本性區(qū)別，只不過(guò)是前者將陰性對(duì)照（N）的2.倍視為Cut-off值而已。

九、結(jié)果報(bào)告及解釋

      抗-HIV/2 ELISA測(cè)定結(jié)果的報(bào)告較為簡(jiǎn)單，報(bào)告“反應(yīng)性”（reactive）或“陽(yáng)性反應(yīng)”和“非反應(yīng)性”（nonreactive）或“陰性反應(yīng)”即可。結(jié)果的解釋比較起來(lái)要復(fù)雜的多，它要求實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員對(duì)所測(cè)定的項(xiàng)目有較為全面的知識(shí)基礎(chǔ)?？?HIV /2 ELISA檢測(cè)屬于初篩檢測(cè)，由于我國(guó)人群流行率低，加上實(shí)際檢測(cè)操作中的一些問(wèn)題，抗-HIV/2檢測(cè)的陽(yáng)性預(yù)示值可能較低，尤其是弱陽(yáng)性反應(yīng)的標(biāo)本。此外，在特定疾病情況下，如自身免疫病亦會(huì)出現(xiàn)較多的假陽(yáng)性。因此，ELISA檢測(cè)呈陽(yáng)性反應(yīng)的標(biāo)本必須進(jìn)一步用蛋白印跡或核酸檢測(cè)進(jìn)行確認(rèn)。此外，陰性反應(yīng)也不能*排除HIV感染的存在?，F(xiàn)在，檢驗(yàn)不再是單純的實(shí)驗(yàn)室測(cè)定，而已成為一門(mén)臨床醫(yī)學(xué)學(xué)科，即檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，這就要求從事醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)工作的檢驗(yàn)醫(yī)師，對(duì)所做的測(cè)定項(xiàng)目除了知其然，還要知其所以然，否則就難免為時(shí)代所淘汰。
      綜上所述，盡管ELISA測(cè)定的操作步驟非常簡(jiǎn)單，但有可能會(huì)影響測(cè)定結(jié)果的因素卻較多，分布在測(cè)定操作的各步之中，尤以加樣、溫育和洗板為甚。為幫助大家分析查找測(cè)定中出現(xiàn)問(wèn)題的可能原因