膠回收dna片段

一、 實驗目的

1、 了解分離純化DNA片段中的污染物方法和原理

二、 實驗原理

首先利用低熔點瓊脂糖凝膠電泳DNA片段，分離目的條帶DNA，然后紫外光下切割含目的DNA條帶的膠塊，利用膠回收試劑盒回收純化DNA片段。試劑盒的膠回收柱采用特殊硅基質材料在一定的高鹽緩沖系統下、專一地吸附DNA、RNA的原理(在高鹽、低pH值情況下吸附DNA;低鹽、高pH值情況下釋放DNA。離心柱上含有Resin合成樹脂，具有吸附DNA的功能)，配備設計*的離心吸附柱式結構，使用常規臺式高速離心機，在幾分鐘之內即可以回收核酸片段。

三、 儀器與試劑

實驗儀器

1、瓊脂糖凝膠電泳系統

2、紫外觀察分析儀

3、離心機

4、單面刀片

5、恒溫水浴鍋

試劑

1、 DNA回收試劑盒

溶膠液：6 M NaClO 4 (pH 5.2) ，0.03M NaAC(pH 5.2)溴酚紅少許

洗液：50 mM Tris-cl，0.1 mM EDTA，pH 8.0) 70%乙醇

存儲液：TE buffer (10 mM Tris-cl，0.1 mM EDTA，pH 8.0).

2、50×TAE(洗液：50 mM Tris-Hcl，0.1 mM EDTA，pH 8.0) 70%乙醇

)

3、ddH2O(重蒸水，蒸餾兩次的水)

四、實驗步驟

1)在紫外燈下切分含DNA的瓊脂糖塊，盡可能除去多余的瓊脂糖.放入1.5ml離心管中。

(切膠回收DNA片段是要把整個目的片斷所在位置的膠全部回收。所以為了減少膠的體積，我們就可以用相對比較薄的膠來跑電泳，通常只要夠點樣即可，或是采用薄而寬的梳子來跑膠。這樣可減少回收試劑引起的一些后續麻煩。)

(紫外燈下切下含待回收DNA的凝膠時，要襯以干凈的塑料薄膜，使用無DNA污染的新刀片，其目的在于防止外源DNA的污染。)

2)按每100mg瓊脂糖加入300—600μl溶膠液的比例加入溶膠液(本實驗加500ul)，置55℃水浴10分鐘，使瓊脂糖塊*溶化，期間每2分鐘顛倒混勻一次促溶。

(利用凝膠回收試劑盒DNA回收效率較低或者未回收到目的片段可能有以下幾個原因：膠塊未*溶解，可適當延長水浴時間，并增加上下顛倒次數輔助溶解;膠塊體積太大，應先將其切為小塊，分多次回收;電泳緩沖液pH太高，硅基質膜在高鹽低pH結合 DNA，如pH太高，應作適當調整;漂洗液中未加入無水乙醇。)

3)將溶化后的瓊脂糖液移入吸附柱，12000rpm 室溫離心1分鐘，倒掉收集管中的液體.再將吸附柱放入同一個收集管中。

4)在吸附柱中加入500ul漂洗液，室溫靜置1分鐘后， 12000rpm 室溫離心30秒，倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中。

5)再在吸附柱中加入500ul漂洗液，12000rpm 室溫離心15秒，倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中。

6) 12000rpm 室溫空離心1分鐘。

(可以改用去離子水洗脫。但是實驗室所用純水一般pH偏低，可利用NaOH適當調高其pH 值，以增加洗脫得率。

洗脫產物含有殘留的乙醇會影響后續酶切實驗，請確保*去除漂洗緩沖液)

7)將吸附柱放入一個干凈的1.5ml的離心管中，在吸附膜加入30ul洗脫緩沖液，室溫靜置2分鐘后， 12000rpm 室溫離心1分鐘(為提高回收效率可再洗脫一次)，將1.5ml離心管(DNA)貯存于-20℃。

8)瓊脂糖凝膠電泳檢測回收產物。

(不可以使用更小洗脫體積(小于說明書提供的zui小洗脫體積)進行洗脫以提高濃度，因為說明書提供的zui少洗脫體積是能*覆蓋吸附膜的zui小體積，若減少體積則不能將DNA*洗脫下來。

電泳檢測只有一條目的帶，可以選用凝膠回收試劑盒。如果后續實驗對片段純度要求較高，建議即使只有一條帶，也可以切膠純化，其回收得到片段的純度可能要比直接回收高一些。

瓊脂糖凝膠膠塊不溶可能是下述原因：瓊脂糖質量不好;含目的片段的凝膠再空氣中放置過久， 使膠塊失水、干燥，建議切膠后立即進行回收或將膠塊保存在4℃或-20℃;制膠的電泳緩沖液濃度過高或陳舊。)

五、注意事項：

§ 切膠時應快速操作，在紫外燈下時間長容易傷害到眼睛;

§ 溴化乙錠染色后的DNA易受紫外光破壞，故盡量放置于暗室，切帶時應使用長波長紫外燈，切膠時間盡量短。

§ 膠塊一定要充分融化，否則將會嚴重影響DNA的回收率。

§ 把洗脫液加熱，使用時有利于提高洗脫液效率。

& 提高膠回收量的辦法：

1) 增加電泳時的上樣量。

2) 電泳緩沖液用新鮮配制的。

3) 切膠時盡量只切有條帶的膠，減小切膠體積：含目的片斷很少的膠就不要了，不然影響回收率。

4) 把切的兩塊或多塊膠融化后，無論多大的體積都用一個管子，轉移到同一個柱子上。

5) 溶膠時所加的溶液可多一點，這樣更有利于DNA與膜的結合，不過一般不要多于750ul。

6) 膠回收的關鍵是通過柱子的溶液的鹽濃度、酸堿性(電荷)和疏水性使DNA與柱子結合，因此，若電泳緩沖液的PH偏高，可在溶膠液中加入10ul(PH 5.0，3mol/L的 NaAC);為了使DNA分子更好 的攔截在膜上，可以添加30%異丙醇在加熱溶解膠后的液體里。

7) 加洗脫液之前，將柱子在室溫放置幾分鐘(大約需10分鐘)，以使乙醇充分揮發。

8)zui后少加些洗脫液，盡量減少回收體積，一般用30-50μl洗脫液洗脫(不能太少，否則無法浸濕膜反而不利于洗脫);洗脫液滴在膜，以充分洗脫結合在 膜上的DNA。

9) 可以在加入洗脫液之后，可以在55度水浴5分鐘或放在50度水浴10分鐘以上再洗脫，或用封口膜密封4度過夜，第二天再離心回收，效果不錯。

10) 將離心后的洗脫液加回吸附柱，再次離心。