習慣上，人們用克隆表示由同一物種具有相同基因型的兩個或多個個體組成的群體。所以，從同一受精卵分裂而來的單卵雙生子（monozygotic twins）便屬于同一克隆。細胞學上，克隆是指由同一個祖細胞（progenitor cell）分裂而來的具有同一遺傳背景的子細胞群體。分子生物學上，把將外源DNA插入具有自主復制能力的載體DNA中，使之得以自主復制和*保存的過程叫做分子克隆。

基因定位克隆或圖位克隆（map-based cloning）是用于分離其編碼產物尚不知道的目的基因的一種有效的方法。具體的步驟是先將目的基因，亦即目的基因的突變定位到染色體上，并在目的基因的兩側確定一對緊密連鎖的RFLP或RAPD分子標記；接著利用zui緊密連鎖的一對兩側分子標記作探針，通過染色體步移技術將位于這兩個分子標記之間的含目的基因的特定的基因組片段克隆并分離出來；zui后是根據其同突變體發生遺傳互補的能力從此克隆中鑒定出目的基因。成功地應用基因定位克隆技術分離目的基因的一個必要條件是，以酵母人工染色體YAC（yeast artificial chromosome）為載體構建含有大片段DNA的YAC庫。另一個必要的條件是要有可用的同目的的基因緊密連鎖的DNA探針。

酵母人工染色體（yeast artificial chromosome。YAC）載體可以克隆數百kb的大分子量的dna片段。YAC載體包括如下的組成部分：
① 一段來自酵母染色體的著絲粒序列；
② 一段控制酵母DNA復制的自主復制序列（autonomously replicatimg sequence，ARS）；
③一對酵母的端粒序列，在有的YAC載體中（例如pYAC4），這對端粒序列來自四膜（Tetrahymena）染色體；
④選擇記號；
⑤克隆位點。
YAC載體能夠如同染色體一樣在酵母細胞中正常地復制，并可以克隆大片段的外DNA，其大小至少可相當于zui大的酵母染色體。應用酵母人工染色體構建真核基因組YAC庫的基本過程如下：首先選用核酸內切限制酶EcoRI和BamHI對YAC載體pYAC4作雙酶消化，結果兩個端粒序列之間的片段便被移走，產生出具有EcoRI粘性末端的兩條臂分子。在每一條臂分子中都帶有一段端粒序列和一個選擇記號。同時再選用一種切割位點的核酸內切限制酶，對高分子量的真核基因組DNA作局部消化。

反應物通過脈沖電場凝膠電泳或密度離心除去分子量小于200kb的DNA片段，收集剩余部分的大分子量的DNA片段，純化后與YAC臂連接。或者是直接從電泳膠中切出含有所需分子量范圍的DNA片段的膠塊，從中提取DNA，并與YAC臂連接。然后再經過一次脈沖電場凝膠電泳，把含有插入序列的YAC載體分離出來，并轉化給已經去掉了細胞壁的酵母細胞，即原生質球。應用存在于兩臂分子上的選擇基因（selectable genes），篩選含有YAC兩臂的酵母克隆。

一、RFLP分子標記

所謂RFLP，即DNA限制片段長度多態性，它是指應用特定的核酸內切限制酶切割有關的DNA分子，所產生出來的DNA片段在長度上的簡單變化。由于核酸內切限制酶是以一種序列特異的方式切割DNA分子，來自一個完整的純合子個體（所有的基因及DNA序列）的每一種同源的DNA分子，都會在同樣的位點被準確地切割。

從不同的生態型（ecotype）或不同的地理隔離群（geographical isolate）植株分離的總DNA中，同源DNA分子通常會表現出序列的趨異性（divergence），形成RFLP。這些RFLP是由于DNA序列上的特定變化（突變）引起的，因此它們也能夠像其他任何遺傳標記一樣進行定位，成為一種十分有用的分子標記。

RFLP作圖的原理與步驟以擬南芥菜為例，簡述RFLP作圖的基本原理與步驟。將實驗的條件限定為：兩個不同的擬南芥菜生態型，即Columbia生態型和Niederzenz生態型；兩個雜交探針，即基因A和基因B；一種核酸內切限制酶EcoRI。從這兩個不同生態型的擬南芥菜提取的兩份總DNA，經過EcoRI限制酶的切割和瓊脂糖凝膠電泳分部分離之后，作Southern轉移，并分別同放射性標記的探針基因A和基因B雜交。

在圖中可以看到，兩親本生態型的DNA，同兩種探針雜交的結果都呈現出多態性現象，這說明在這兩個生態型的不同大小的DNA限制片段上，都存在著基因A和基因B的序列。F1代是雜合子，正如我們預期的情況一樣，它含有兩親本的限制片段。由這些F1代植株自花授粉所產生的F2代植株中，也會出現這種預期的1：2：1的分離模式。這兩個基因是獨立分配還是連鎖分配，會表現出非常不同的結果。

目前還可用其他分子標記如SSLP和CAPS等進行分子作圖。

二、染色體步移

染色體步移的起點是具有一個與待分離的目的基因盡可能靠近的已經鑒定的分子標記。這種標記可以是RFLP，也可以是已知的基因克隆。

先構建起點RFLP標記克隆的限制圖，并把其中zui靠近目的基因的限制片段亞克隆出來。此限制片段經放射性同位素標記之后，用作分子雜交探針，從基因組文庫中篩選與起點克隆具有重疊序列的新克隆（稱之為一步克隆）。重復進行上述的各個步驟。構建一步克隆的限制圖，亞克隆其中zui靠近目的基因的限制片段，該片段經放射性同位素標記之后，用作分子雜交探針從基因組文庫中篩選與一步克隆具有重復序列的新克隆（稱之為二步克隆）。如此重復進行多次，每得到一個新的克隆都更接近目的基因一步，直至zui后獲得了目的基因的克隆。由于這種技術是通過逐一克隆來自染色體基因組DNA的彼此重疊的序列，而慢慢靠近目的基因，因此