一、材料與方法

1.  EDTA（無蛋白酶抑制劑）（Roche）

2.  酸沖洗過的425-600玻璃珠（Sigma）

3.  洋地黃皂苷（digitonin）（EMDChemicals）

4.  蛋白酶抑制劑（DMSO,亮肽素,抑制劑）（Sigma）

5.  BECKMAN1.5 ml 離心管（BECKMAN）

6.  抗FlagM2親和膠（Sigma）

7.  3XFLAG多肽（Sigma）

二、儀器設備

1.  BECKMAN離心機、TLA-55轉子

三、實驗步驟

1.  細胞裂解

（1）酵母搖至25OD，集菌。4℃，用1 ml H₂O或PBS緩沖液洗滌細胞。若需要，可在-80℃保存樣品。

（2）用150 ul 預冷好的免疫沉淀緩沖液重懸細胞，緩沖液（無DTT）中加入0.1%digitonin和蛋白酶抑制劑以及磷酸酶抑制劑。加入玻璃珠沒于液面下。在冷藏室，渦旋振蕩10分鐘。Digitonin是強刺激性非離子去污劑，可以完整提取膜蛋白。

（3）加入850 ul 免疫沉淀緩沖液（包含1.16%Digitonin和蛋白酶抑制劑，無DTT），定容至1 ml。此時Digitonin終濃度為1%。4℃，翻轉搖床孵育30分鐘，此過程中膜蛋白可溶于緩沖液中。轉移液體至新的BECKMAN離心管中。

（4）100 000 g 離心10分鐘，去除為裂解的細胞、細胞核、細胞膜。膜蛋白已從膜上分離，溶于上清中。離心（用TLA-55轉子，47 246 rpm），吸取上清。保存80 μl 上清，作為input對照。

2.  帶有FLAG標簽的蛋白的免疫沉淀反應

（1）每個反應使用50 μl 膠懸浮液。（~25 μl 填充膠）。若使用親和柱則使用量更小（~10 μl 填充膠，可以結合>1 μg FLAG-標簽蛋白）。

（2）懸起抗-FLAGM2親和柱。懸浮液與填充膠的比例應為2：1。轉移50 μl 懸浮緩沖液及親和柱至新的試管中。轉移應使用移液管，并剪去其尖頭。

（3）400 g 離心1分鐘。靜置1~2分鐘。用移液管去除上清。

（4）用1 ml 含有0.1%digitonin的免疫沉淀緩沖液漂洗吸附柱，重復4次。洗滌過程中盡量保證漂洗液去除干凈，并且沒有丟失吸附柱。這是為了確保在蛋白結合柱子前，甘油已經*去除。如果免疫沉淀樣品較多，可以同時漂洗吸附柱。在漂洗后，根據樣品數量分配吸附柱。每次漂洗，應使用大于吸附柱體積20倍的漂洗液。（如25 μ l吸附柱，>500 μl 漂洗液）

（5）向漂洗過的吸附柱中加入800 μl 細胞裂解產物。可以用免疫沉淀緩沖液將總體積定容至1 ml。細胞裂解產物的體積取決于細胞中表達的帶有FLAG標簽的蛋白的量。加入1 ml 裂解緩沖液作為負對照。

（6）攪動樣品，在翻轉搖床上輕柔孵育2.5小時。

（7）400× g 離心1分鐘。用移液管去除上清。保存80 μl 上清作為未結合對照。

（8）用1 ml 免疫沉淀緩沖液漂洗吸附柱，重復4次。

3.  洗脫帶有FLAG標簽的蛋白

用3×FLAG多肽洗脫。此方法洗脫效率*

（1）準備3×FLAG洗脫緩沖液。加入30 μl 漂洗緩沖液（含0.25%digitonin和2 μg/μl 3×FLAG多肽）

（2）向有吸附柱的試管中加入30 μl 3×FLAG洗脫緩沖液。

（3）4℃，搖床輕柔孵育30分鐘。

（4）400~1 000× g 離心1分鐘。將上清轉移至新試管中。注意不要吸入吸附柱