基因組(genome)包含的遺傳信息經(jīng)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生mRNA,一個細胞在特定生理或病理狀態(tài)下表達的所有種類的mRNA稱為轉(zhuǎn)錄子組(transcriptome)。很顯然,不同細胞在不同生理或病理狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄子組包含的mRNA的種類不盡相同。mRNA經(jīng)翻譯產(chǎn)生蛋白質(zhì),一個細胞在特定生理或病理狀態(tài)下表達的所有種類的蛋白質(zhì)稱為蛋白質(zhì)組(proteome)。同理,不同細胞在不同生理或病理狀態(tài)下所表達的蛋白質(zhì)的種類也不盡相同。蛋白質(zhì)是基因功能的實施者,因此對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),定位和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的研究將為闡明生命現(xiàn)象的本質(zhì)提供直接的基礎(chǔ)。
生命科學是實驗科學,因此生命科學的發(fā)展地依賴于實驗技術(shù)的發(fā)展。以DNA序列分析技術(shù)為核心的基因組研究技術(shù)推動了基因組研究的日新月異,而以基因芯片技術(shù)為代表的基因表達研究技術(shù)為科學家了解基因表達規(guī)律立下汗馬功勞。在蛋白質(zhì)組研究中,二維電泳和質(zhì)譜技術(shù)的黃金組合又為科學家掌握蛋白質(zhì)表達規(guī)律再鑄輝煌。蛋白質(zhì)組學(proteomics)就是指研究蛋白質(zhì)組的技術(shù)及這些研究得到的結(jié)果。
蛋白質(zhì)組學的研究試圖比較細胞在不同生理或病理條件下蛋白質(zhì)表達的異同,對相關(guān)蛋白質(zhì)進行分類和鑒定。更重要的是蛋白質(zhì)組學的研究要分析蛋白質(zhì)間相互作用和蛋白質(zhì)的功能。
蛋白質(zhì)組學的研究內(nèi)容包括:
1.蛋白質(zhì)鑒定:可以利用一維電泳和二維電泳并結(jié)合Western等技術(shù),利用蛋白質(zhì)芯片和抗體芯片及免疫共沉淀等技術(shù)對蛋白質(zhì)進行鑒定研究。
2.翻譯后修飾:很多mRNA表達產(chǎn)生的蛋白質(zhì)要經(jīng)歷翻譯后修飾如磷酸化,糖基化,酶原激活等。翻譯后修飾是蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)功能的重要方式,因此對蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究對闡明蛋白質(zhì)的功能具有重要作用。
3.蛋白質(zhì)功能確定:如分析酶活性和確定酶底物,細胞因子的生物分析/配基-受體結(jié)合分析??梢岳没蚯贸头戳x技術(shù)分析基因表達產(chǎn)物-蛋白質(zhì)的功能。另外對蛋白質(zhì)表達出來后在細胞內(nèi)的定位研究也在一定程度上有助于蛋白質(zhì)功能的了解。Clontech的熒光蛋白表達系統(tǒng)就是研究蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)定位的一個很好的工具。
4.對人類而言,蛋白質(zhì)組學的研究zui終要服務(wù)于人類的健康,主要指促進分子醫(yī)學的發(fā)展。如尋找藥物的靶分子。很多藥物本身就是蛋白質(zhì),而很多藥物的靶分子也是蛋白質(zhì)。藥物也可以干預蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。
在基礎(chǔ)醫(yī)學和疾病機理研究中,了解人不同發(fā)育、生和不同生理、病理條件下及不同細胞類型的基因表達的特點具有特別重要的意義。這些研究可能找到直接與特定生理或病理狀態(tài)相關(guān)的分子,進一步為設(shè)計作用于特定靶分子的藥物奠定基礎(chǔ)。
不同發(fā)育、生和不同生理、病理條件下不同的細胞類型的基因表達是不一致的,因此對蛋白質(zhì)表達的研究應(yīng)該到細胞甚至亞細胞水平??梢岳妹庖呓M織化學技術(shù)達到這個目的,但該技術(shù)的致命缺點是通量低。LCM技術(shù)可以地從組織切片中取出研究者感興趣的細胞類型,因此LCM技術(shù)實際上是一種原位技術(shù)。取出的細胞用于蛋白質(zhì)樣品的制備,結(jié)合抗體芯片或二維電泳-質(zhì)譜的技術(shù)路線,可以對蛋白質(zhì)的表達進行原位的高通量的研究。很多研究采用勻漿組織制備蛋白質(zhì)樣品的技術(shù)路線,其研究結(jié)論值得懷疑,因為組織勻漿后不同細胞類型的蛋白質(zhì)混雜在一起,zui后得到的研究數(shù)據(jù)根本無法解釋蛋白質(zhì)在每類細胞中的表達情況。雖然培養(yǎng)細胞可以得到單一類型細胞,但體外培養(yǎng)的細胞很難模擬體內(nèi)細胞的環(huán)境,因此這樣研究得出的結(jié)論也很難用于解釋在體實際情況。因此在研究中首先應(yīng)該將不同細胞類型分離,分離出來的不同類型細胞可以用于基因表達研究,包括mRNA和蛋白質(zhì)的表達。LCM技術(shù)獲得的細胞可以用于蛋白質(zhì)樣品的制備??梢愿鶕?jù)需要制備總蛋白,或膜蛋白,或核蛋白等,也可以富集糖蛋白,或通過去除白蛋白來減少蛋白質(zhì)類型的復雜程度。相關(guān)試劑盒均有廠商提供。
蛋白質(zhì)樣品中的不同類型的蛋白質(zhì)可以通過二維電泳進行分離。二維電泳可以將不同種類的蛋白質(zhì)按照等電點和分子量差異進行高分辨率的分離。成功的二維電泳可以將2000到3000種蛋白質(zhì)進行分離。電泳后對膠進行高靈敏度的染色如銀染和熒光染色。如果是比較兩種樣品之間蛋白質(zhì)表達的異同,可以在同樣條件下分別制備二者的蛋白質(zhì)樣品,然后在同樣條件下進行二維電泳,染色后比較兩塊膠。也可以將二者的蛋白質(zhì)樣品分別用不同的熒光染料標記,然后兩種蛋白質(zhì)樣品在一塊膠上進行二維電泳的分離,zui后通過熒光掃描技術(shù)分析結(jié)果。
膠染色后可以利用凝膠圖象分析系統(tǒng)成像,然后通過分析軟件對蛋白質(zhì)點進行定量分析,并且對感興趣的蛋白質(zhì)點進行定位。通過專門的蛋白質(zhì)點切割系統(tǒng),可以將蛋白質(zhì)點所在的膠區(qū)域進行切割。接著對膠中蛋白質(zhì)進行酶切消化,酶切后的消化物經(jīng)脫鹽/濃縮處理后就可以通過點樣系統(tǒng)將蛋白質(zhì)點樣到特定的材料的表面(MALDI-TOF)。zui后這些蛋白質(zhì)就可以在質(zhì)譜系統(tǒng)中進行分析,從而得到蛋白質(zhì)的定性數(shù)據(jù);這些數(shù)據(jù)可以用于構(gòu)建數(shù)據(jù)庫或和已有的數(shù)據(jù)庫進行比較分析。實際上像人類的血漿,尿液,腦脊液,乳腺,心臟,膀胱癌和磷狀細胞癌及多種病原微生物的蛋白質(zhì)樣品的二維電泳數(shù)據(jù)庫已經(jīng)建立起來,研究者可以登錄www.expasy.ch/www/tools.html等進行查詢,并和自己的同類研究進行對比分析。
Genomic Solution可以為研究者提供除質(zhì)譜外的所有蛋白質(zhì)組學研究工具,包括二維電泳系統(tǒng),成像系統(tǒng)及分析軟件,膠切割系統(tǒng),蛋白質(zhì)消化濃縮工作站,點樣工作站等;同時還可以提供相關(guān)試劑和消耗品。
LCM-二維電泳-質(zhì)譜的技術(shù)路線是典型的一條蛋白質(zhì)組學研究的技術(shù)路線,除此以外,LCM-抗體芯片也是一條重要的蛋白質(zhì)組學研究的技術(shù)路線。即通過LCM技術(shù)獲得感興趣的細胞類型,制備細胞蛋白質(zhì)樣品,蛋白質(zhì)經(jīng)熒光染料標記后和抗體芯片雜交,從而可以比較兩種樣品蛋白質(zhì)表達的異同。Clontechzui近開發(fā)了一張抗體芯片,可以對378種膜蛋白和胞漿蛋白進行分析。該芯片同時配合了抗體芯片的全部操作過程的重要試劑,包括蛋白質(zhì)制備試劑,蛋白質(zhì)的熒光染料標記試劑,標記體系的純化試劑,雜交試劑等。