巨噬細(xì)胞培養(yǎng)
巨噬細(xì)胞屬免疫細(xì)胞，有多種功能，是研究細(xì)胞吞噬、細(xì)胞免疫和分子免疫學(xué)的重要對象。巨噬細(xì)胞容易獲得，便于培養(yǎng)，并可進(jìn)行純化。巨噬細(xì)胞屬不繁殖細(xì)胞群，在條件適宜下可生活2－3周，多用做原代培養(yǎng)，難以生存。
巨噬細(xì)胞也建有無限細(xì)胞系，大多來自小鼠，如P331、S774A.1、RAW309Cr.l等，均獲惡性，培養(yǎng)中呈巨噬細(xì)胞形態(tài)和吞噬功能，易于傳代和瓶壁分離，但難以建株。
培養(yǎng)巨噬細(xì)胞可用各樣方法和各種來源來獲取細(xì)胞，以小鼠腹腔取材法zui為實(shí)用，其法如下：
1、實(shí)驗(yàn)前三天，向小鼠腹腔內(nèi)注入無菌硫羥乙酸肉湯lml（勿注入腸內(nèi)！），以刺流產(chǎn)生大量的巨噬細(xì)胞。
2、引頸處死小鼠。
3、手提鼠尾將其全浸入70%乙醇中3－5秒。
4、置動物于解剖臺，用針頭固定四肢，持鑷撕開腹部皮膚，但勿傷及腹膜壁，把皮膚拉向上下兩側(cè)，暴露出腹膜壁。
5、用70%酒精擦洗腹膜壁，注射器吸10ml Eagle液注入腹腔中，同時用手指從兩側(cè)壓揉腹膜壁，使液體在腹腔內(nèi)流動。
6、用針頭輕挑起腹壁并微傾向一側(cè)．使腹腔中液體集中于針頭下吸取入針管內(nèi)。
7、小心拔出針頭，把液體注入離心管。
8、4℃下250g離心10分鐘后，去上清，加10ml Eagle培養(yǎng)基。
9、計(jì)數(shù)細(xì)胞。每只鼠可產(chǎn)生20一30×106細(xì)胞，其中90%為巨噬細(xì)胞。
10、以3×105個貼附細(xì)胞/平方厘米接種。
11、接種數(shù)小時后，除去培養(yǎng)液，可去除其它白細(xì)胞，純化培養(yǎng)細(xì)胞，用Eagle液沖洗1一2次，再加新Eagle培養(yǎng)液置CO2溫箱中。
上皮細(xì)胞培養(yǎng)
1、取材：外科植皮或手術(shù)殘余皮膚小塊，早產(chǎn)流產(chǎn)兒皮膚更好，取角化層薄者，切成0.5－1平方厘米小塊。
2、置0.02%EDTA中，室溫，5分鐘。
3、換入0.25%中，4℃過夜。
4、分離：取出皮塊，用或鑷子將表皮與層分開。
5、取出表皮，剪成更小的塊后，置0.25%中，37℃，30—60分鐘。
6、反復(fù)吹打，制成懸液。
7、培養(yǎng)：用80目不銹鋼紗網(wǎng)濾過后，低速離心，吸去上清。
8、直接加入培養(yǎng)基（Eagle加20%小牛血清）制成細(xì)胞懸液，接種入培養(yǎng)瓶，CO2溫箱培養(yǎng)。體細(xì)胞培養(yǎng)
1、瓊脂鋪底的培養(yǎng)瓶：30ml無菌培養(yǎng)瓶，每瓶中加5 ml 2%瓊脂培養(yǎng)基，冷卻，形成平坦底層后備用。
2、取生長狀態(tài)良好已連接成片的細(xì)胞，用彎頭吸管伸入瓶內(nèi)，把細(xì)胞縱橫割劃成若干小區(qū)后，倒出培養(yǎng)液。
3、加入0.25%的液，在倒置顯微鏡下邊消化邊觀察，當(dāng)細(xì)胞小區(qū)邊緣微卷起后便立即終止消化，倒出消化液，用Hanks輕輕漂洗一次，加入新培養(yǎng)液3~5 ml，用吸管把已松動的細(xì)胞片吸打下來，分裝入1~3個含2%瓊脂培養(yǎng)基底層的培養(yǎng)瓶中，置溫箱繼續(xù)培養(yǎng)，數(shù)日后便可生長成細(xì)胞球體。
4、換液：培養(yǎng)1~2日后，如需換液，微傾斜培養(yǎng)瓶，令培養(yǎng)液集于培養(yǎng)瓶底角，停片刻，待球體細(xì)胞下沉后，吸除部分培養(yǎng)液，再補(bǔ)充新培養(yǎng)液。
羊水細(xì)胞培養(yǎng)
羊水中含有胎兒脫落的上皮細(xì)胞，可在體外培養(yǎng)用以分析胎兒染色體核型。目前國內(nèi)外大都采用腹腔羊膜穿刺術(shù)，妊娠12-30周的羊水細(xì)胞均可培養(yǎng)成功。羊膜腔穿刺取羊水行染色體分析，*孕周為16周左右。因此時羊水增長快，羊水中細(xì)胞較多，細(xì)胞培養(yǎng)易于生長，而且不易損傷胎兒。國內(nèi)多數(shù)選擇的穿刺時間在妊娠的第16-30周。國外現(xiàn)已較多地采用妊娠早期的羊膜穿刺，但需在B超下定位及穿刺。羊水量按妊娠時間大致計(jì)算（1ml/w）。資料表明，穿刺病例的妊娠結(jié)局、分娩方式、胎兒的出生體重等與未穿刺無明顯差異。
1、實(shí)驗(yàn)材料
2,5%碘酒、75%酒精、無菌棉簽和棉球、鑷子、20-22號無菌腰穿針、吸管、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)液（PRMI 1640、199、F10、F12）、小牛血清、秋水仙素、KCL、甲醇、冰醋酸、培養(yǎng)皿、蓋玻片等。
2、培養(yǎng)液配制
F-12 85%
小牛血清 15%
雙抗 100u/ml
小瓶貯藏 4-8℃
3、操作過程
A（蓋玻片培養(yǎng)法）
（1）采樣：選擇妊娠13-14周婦女，在無菌條件下抽取羊水5ml，立即注入無菌離心管中；（2）收集：離心分離細(xì)胞，1000rpm10分鐘，去上清，留0.5ml，輕打混勻；（3）接種：30mm培養(yǎng)皿中放蓋玻片1張，每片滴混勻的細(xì)胞液1-2滴，置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)30-60分鐘；（4）培養(yǎng)：取出后從蓋玻片外加培養(yǎng)液2ml，靜置培養(yǎng)48小時后觀察細(xì)胞生殖狀況并定時換液，5-10天后，可見大量成纖維細(xì)胞或上皮樣細(xì)胞生長；（5）終止培養(yǎng)：當(dāng)有大量圓形發(fā)亮細(xì)胞出現(xiàn)時，加秋水仙素0.02-0.04ug/ml，作用10-12小時；（6）低滲：倒掉培養(yǎng)液，加預(yù)溫37℃0.075MKCL溶液5ml，37℃溫育30分鐘，鏡下可見脹大的羊水細(xì)胞，加0.5-1ml 3∶1甲醇：冰醋酸固定液預(yù)固定；（7）固定：倒掉低滲液，加5ml固定液固定30分鐘以上，反復(fù)3次；（8）干燥：將附有細(xì)胞的蓋玻片斜放于培養(yǎng)皿中，置80℃烤箱處理2-3小時；（9）膠片：將附有細(xì)胞的蓋玻片用樹脂膠封固于玻片上，正面朝外，小心細(xì)胞破壞；
B（常規(guī)培養(yǎng)法）
（1）—（2）相同于蓋玻片培養(yǎng)法；（3）接種：將混勻的羊水細(xì)胞種置于50ml或100ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，平均10ml羊水細(xì)胞收集的細(xì)胞種置一瓶加5-10ml混合培養(yǎng)液。（4）培養(yǎng)：酒精燈火先封口，靜置培養(yǎng)48小時后觀察細(xì)胞貼臂及生長情況，5-10天后可見瓶底面有大量羊水細(xì)胞生長；（5）終止培養(yǎng)：同A法；（6）細(xì)胞收集：將培養(yǎng)液倒入一干凈離心管中，加0.025%的0.5-1ml/瓶，輕輕搖動，使培養(yǎng)瓶底面*接觸消化酶，然后用彎頭吸管吹打，待細(xì)胞全部脫落后加前培養(yǎng)液終止消化。用吸管移細(xì)胞懸液于離心管中。1000-2000rpm10分鐘，棄上清，留細(xì)胞沉慮。若一次消化不*，可反復(fù)消化；（7）低滲及預(yù)固定：加預(yù)溫37℃KCL溶液10ml，37℃溫育30分鐘，加0.5-1ml新鮮配制的3∶1甲醇冰乙酸固定液預(yù)固定，用氣泡吹打細(xì)胞使其混勻。（8）固定：用新鮮配制的3∶2甲冰固定三次，每次30分鐘。固定液加入時沿管壁緩慢加入；（9）制片及干燥：用絨毛制片；（10）分帶處理。
血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)
研究人內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)以人臍帶靜脈灌流消化法zui為簡便，其法如下：
1、產(chǎn)后新鮮臍帶，無菌剪取10—15厘米長一段，如不能立即培養(yǎng)，可于12小時內(nèi)保存于4℃。
2、用三通注射器吸取溫PBS液注入臍靜脈中洗去殘血，在入口處用線繩扎緊，以防液體返流。
3、用夾緊臍帶一端，從另一端向臍靜脈中徐徐注入終濃度為0.1%的粗制膠原酶，充滿血管，消化3—10分鐘；注入口用線繩扎，以防液體返流。
4、吸出含有內(nèi)皮細(xì)胞的消化液，于離心管中，注入溫PBS輕輕反復(fù)沖洗后，一并注入離心管中（此步驟可重復(fù)）。5、離心去上清，加入RPMI1640培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，接種入培養(yǎng)器皿中，置溫箱培養(yǎng)。兩至三天可見細(xì)胞長成單層。
原代軟骨細(xì)胞分離培養(yǎng)
1、一般根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，選取不同年齡組的兔子，實(shí)際上兔子的年齡越小越好，畢竟幼體組織的活力要高于成體組織的活力，耳靜脈空氣注射法處死后,無菌條件下分離后肢關(guān)節(jié)軟骨和肋軟骨，剝離包裹軟骨組織的筋膜和軟骨膜，放入盛有PBS液的培養(yǎng)皿中。
2、將分離得到的軟骨組織剁碎成0.3-0.5mm的組織塊，移入25cm2培養(yǎng)瓶，用含雙抗的PBS液沖洗軟骨3次。
3、加入軟骨體積10-15倍的0.25%，37℃消化１－２小時后終止消化。
4、加入0.02%II型膠原酶，37℃消化17-20小時（也就是過夜），這是我們實(shí)驗(yàn)室摸索出來的方法，雖然比較浪費(fèi)時間，但是獲得的細(xì)胞活力確實(shí)不錯。
5、在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)游離出單個細(xì)胞后，加入DMEM培養(yǎng)液將II型膠原酶稀釋終止消化。
6、將細(xì)胞團(tuán)吹打成單個細(xì)胞后用200目濾網(wǎng)過濾，收集濾液，1500r/min離心5min。
7、棄上清，加入DS培養(yǎng)液重懸，0.2%臺盼藍(lán)染色，活細(xì)胞率大于90%，CO2培養(yǎng)箱孵育。
