*部分
一、 基本步驟：
1、目的基因(DNA和mrna)的查找和比對;
2、引物、探針的設計;
3、引物探針的合成;
4、反應體系的配制;
5、反應條件的設定;
6、反應體系和條件的優化;
7、熒光曲線和數據分析;
8、標準品的制備;
二、技術關鍵：
1、 目的基因(DNA和mRNA)的查找和比對;
從http://www.ncbi.nlm.nih.gov/網點的genbank中下載所需要的序列。下載的方式有兩種：一為打開某個序列后，直接點擊“save”，保存格式為“.txt”文件。保存的名稱中要包括序列的物種、序列的亞型、序列的注冊號。然后，再打開DNAstar軟件中的Editseq軟件，點擊“file”菜單中的“import”，打開后點擊“save”，保存為“.seq”文件。另一種直接用DNAstar軟件中的Editseq軟件，點擊“file”菜單中的“open entrez sequence”，導入后保存為“.seq”文件，保存的名稱中要包括序列的物種、序列的亞型、序列的注冊號。然后要對所有的序列進行排序。用DNAstar軟件中的Seqman軟件，點擊“sequence”菜單中的“add”，選擇要比較的“.seq”的所有文件，點擊“add” 或“add all”，然后點擊“Done”導入要比較的序列，再點擊“assemble”進行比較。橫線的上列為一致性序列，所有紅色的堿基是不同的序列，一致的序列用黑色堿基表示。有時要設定比較序列的開始與結尾。有時因為參數設置的原因，可能分為幾組(contig)，若想全部放在一組中進行比較，就調整“project” 菜單下的“parameter”，在“assembling”內的“minimum math percentage”默認設置為80，可調低即可。再選擇幾個組，點擊“contig”菜單下的“reassemble contig”即可。選擇高低的原則是在保證所分析的序列在一個“contig”內的前提下，盡量提高“minimum math percentage”的值。有時因此個別序列原因，會出現重復序列，堿基的缺失或插入，要對“contig”的序列的排列進行修改，確保排列是每個序列的真實且排列同源性的排列。然后，點擊“save”保存即可。分析時，主要是觀察是否全部為一致性的黑色或紅色，對于彌散性的紅色是不可用的。
2、 引物和探針設計
2.1引物設計
細心地進行引物設計是PCR中zui重要的一步。理想的引物對只同目的序列兩側的單一序列而非其他序列退火。設計糟糕的引物可能會同擴增其他的非目的序列。下面的指導描述了一個可以增加特異性的引物所具有的令人滿意的特點：
²序列選取應在基因的保守區段;
²擴增片段長度根據技術的不同有所分別：
sybr green I技術對片段長度沒有特殊要求;
Taqman探針技術要求片段長度在50bp-150bp;
²避免引物自身或與引物之間形成4個或4個以上連續配對;
²避免引物自身形成環狀發卡結構;
²典型的引物18到24個核苷長。引物需要足夠長，保證序列*性，并降低序列存在于非目的序列位點的可能性。但是長度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產量。Tm值在55-65℃，GC含量在40%-60%;
²引物之間的TM相差避免超過2℃;
²引物的3’端避免使用堿基A;
²引物的3’端避免出現3個或3個以上連續相同的堿基。
²為避免基因組的擴增，引物設計能跨兩個外顯子。