實驗原理

所謂大腸菌群，是指在37℃培養(yǎng)24h 內(nèi)能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣的兼性厭氧的革藍氏陰性無芽孢桿菌的總稱。主要由腸桿菌科中四個屬內(nèi)的細菌組成，即埃希氏桿菌屬、檸檬酸桿菌屬、克雷伯氏菌屬和腸桿菌屬。

水的大腸菌群數(shù)是指100 mL水檢樣內(nèi)含有的大腸菌群實際數(shù)值，以大腸菌群zui近似數(shù)(MPN)表示。在正常情況下，腸道中主要有大腸菌群、糞鏈球菌和厭氧芽孢桿菌等多種細菌。這些細菌都可以隨人畜排泄物進入水源，由于大腸菌群在腸道內(nèi)數(shù)量多，所以，水源中大腸菌群的數(shù)量，是直接反映水源被人畜排泄物污染的一項重要指標(biāo)。目前，上已*大腸菌群是糞便污染的指標(biāo)。因而對飲用水必須進行大腸菌群的檢查。

水中大腸菌群的檢測方法，常用多管發(fā)酵法和濾膜法。多管發(fā)酵法可適用于各種水樣的檢驗，但操作繁瑣，需要的時間較長。濾膜法僅適用于自來水和深井水，操作簡單、快速，但不適用于雜質(zhì)較多、易于堵塞濾孔的水樣。

材料與器皿

(—)培養(yǎng)基

1、普通乳糖蛋白胨培養(yǎng)液

蛋白胨 10g，牛肉膏 3g，乳糖5g，氯化鈉 5g，1.6%溴甲酚紫乙醇液 1.0mL，蒸餾水 1000mL，pH 7.2~7.4。

將蛋白胨、牛肉膏、乳糖、氯化鈉加熱溶解于1000mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH為7.2~7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇液1.0mL，充分混勻，分裝于有杜漢氏小管的試管中，每管10mL，115℃滅菌20min。

2、三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液

按上述普通乳糖蛋白胨培養(yǎng)液濃縮三倍配制，分裝于有杜漢氏小管的試管中，每管5mL。

1、 品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基(供平板分離用)

蛋白胨 10g， 乳糖 10g，K2HPO4 3.5g，瓊脂 15～20g，蒸餾水1000mL，無水亞硫酸鈉 5g，5%的堿性品紅乙醇溶液 20mL，pH 7.2~7.4。

4、伊紅美藍培養(yǎng)基(EMB培養(yǎng)基)(供發(fā)酵法平板分離用，3和4可任選一種)

蛋白胨10g，乳糖10g，K2HPO4 2.0g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL，2%伊紅(曙紅)水溶液 20mL，5%美藍()水溶液13mL，pH 7.2~7.4。

(二)滅菌移液管、滅菌稀釋水、試管、杜漢氏小管、革蘭氏染色液、滅菌培養(yǎng)皿。

實驗過程

(一)水樣的采集

供細菌學(xué)檢驗的水樣，必須按一般無菌操作的基本要求采集，并保證再運送、貯存過程中不受污染。水樣從采集到檢驗不應(yīng)超過4h ，在0～4℃下保存不應(yīng)超過24h ，如不能在4h 內(nèi)分析，應(yīng)在檢驗報告上注明保存時間和條件。

1、自來水取樣：應(yīng)在水打開放水5min ，再用無菌容器接取水樣，待分析。如水樣內(nèi)含有余氯，則采樣瓶滅菌后按每500mL水樣加3%Na2S2O3.5H2O溶液1mL。

2、江、河、湖、池自然水體取樣：可用采樣器，采樣瓶應(yīng)先滅菌。采樣后，瓶內(nèi)應(yīng)留有空隙。如果與其他化驗項目聯(lián)合取樣，細菌學(xué)分析水樣應(yīng)采在其他樣品之前。

(二)初發(fā)酵試驗

1、水樣稀釋：制備水樣10-1、10-2的稀釋液，方法為用無菌移液管吸取水樣10mL放于盛有90mL無菌水和若干玻璃珠的錐形瓶中，充分振蕩使混合均勻，并使其中的細菌盡量呈單個存在，即為10-1稀釋液;再從10-1制備10-2稀釋液。以此類推，稀釋到所需倍數(shù)。

2、接種和培養(yǎng)：以無菌操作于5支三倍濃縮培養(yǎng)基(接種前一定應(yīng)先檢查杜漢氏小管內(nèi)有無氣泡)中各加入水樣10mL，5支普通培養(yǎng)基試管中加入水樣1mL，5支普通培養(yǎng)基試管中加入10-1稀釋液1mL， 小心混勻放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h 。此即5管法。

3、結(jié)果觀察：37℃中培養(yǎng)24h后取出觀察，觀察有無氣體(杜漢氏小管內(nèi)有無氣體)和酸產(chǎn)生(培養(yǎng)基有無變色)。在48h之間，培養(yǎng)管內(nèi)倒置的杜漢氏小管內(nèi)有任何量的氣體積累，或培養(yǎng)基顏色從紫色變?yōu)辄S色，便可初步斷定為陽性反應(yīng)。

若實驗所測定的15支管中均為陽性反應(yīng)，說明濃水樣污染嚴(yán)重，可將樣品進一步稀釋后，再按上述方法接種、培養(yǎng)和觀察。

(三)平板培養(yǎng)試驗

將初發(fā)酵實驗中產(chǎn)酸產(chǎn)氣的后只產(chǎn)酸或只產(chǎn)氣的試管中的培養(yǎng)物用接種環(huán)取少許，劃線接種在品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基或伊紅美藍培養(yǎng)基平板上，為了確保獲得分離的單菌落，須注意以下事項：

(1)劃線間距至少相隔0.5厘米;

(2)接種釘要稍彎;

(3)先對試管輕擊并使之傾斜，以免接種針挑取到任何膜狀物或浮渣;

(4)劃線時要用針尖的彎曲部分接觸瓊脂培養(yǎng)基平面.以免刮傷或戳破培養(yǎng)基。劃線后培養(yǎng)皿倒置，于37℃培養(yǎng)18～24h。

24h后，觀察在平板上出現(xiàn)的單個菌落，其核心有深綠色金屬光澤者為較典型的大腸菌群菌落。盡可能挑取典型的或接近典型的大腸菌群菌落，在營養(yǎng)瓊脂斜面上劃線，置37℃培養(yǎng)24h。挑取斜面培養(yǎng)物制成涂片，進行革蘭氏染色，凡屬革蘭氏陰性桿菌，即確認了大腸菌群細菌的存在.

(四)復(fù)發(fā)酵驗證實驗

經(jīng)上述經(jīng)染色為革蘭氏陰性的典型菌落，用接種環(huán)刮取部分接種于盛有乳糖培養(yǎng)基的試管中，在37℃培養(yǎng)24h，陽性反應(yīng)者即確認為大腸菌群細菌。

結(jié)果計算

在初發(fā)酵試驗中，可能有極少數(shù)能發(fā)酵乳糖產(chǎn)氣的非大腸菌群細菌混在陽性可疑反應(yīng)管中，通過對初發(fā)酵中的陽性可疑管進行平板和復(fù)發(fā)酵試驗，并進行革蘭氏染色和細菌形態(tài)的觀察，可將那些少量的非大腸菌群細菌(“假陽性管”)刪除去，故在記錄時只能把三步試驗都呈陽性的試管計入陽性反應(yīng)管。

如果初發(fā)酵接種水樣量為10mL、1mL、0.1mL，可直接查表求出原水樣100mL中大腸菌群指數(shù)(MPN)。如果接種水樣量低于上述水樣量，則經(jīng)下面的換算式計算。

目前我國系以1L水樣中的菌數(shù)為報告值，即為MPN×10。

水樣的總大腸菌群檢索表