核酸的分離與純化技術是生物化學與分子生物學的一項基本技術。隨著分子生物學技術廣泛應用于生物學、醫學及其相關等領域,核酸的分離與純化技術也得到進一步發展。各種新方法、經完善后的傳統經典方法以及商品試劑方法的不斷出現,地推動了分子生物學的發展。現就核酸分離與純化的原理及其方法學進展作一綜述。

核酸分離與純化的原則

核酸在細胞中總是與各種蛋白質結合在一起的。核酸的分離主要是指將核酸與蛋白質、多糖、脂肪等生物大分子物質分開。在分離核酸時應遵循以下原則:保證核酸分子一級結構的完整性;排除其他分子污染。

核酸分離與純化的步驟

大多數核酸分離與純化的方法一般都包括了細胞裂解、酶處理、核酸與其他生物大分子物質分離、核酸純化等幾個主要步驟。每一步驟又可由多種不同的方法單獨或聯合實現。

1. 細胞裂解:核酸必須從細胞或其他生物物質中釋放出來。細胞裂解可通過機械作用、化學作用、酶作用等方法實現。

(1) 機械作用:包括低滲裂解、超聲裂解、微波裂解、凍融裂解和顆粒破碎等物理裂解方法。這些方法用機械力使細胞破碎,但機械力也可引起核酸鏈的斷裂,因而不適用于高分子量長鏈核酸的分離。有報道超聲裂解法提取的核酸片段長度從< 500bp ～ > 20kb 之間,而顆粒勻漿法提取的核酸一般< 10kb。

(2) 化學作用:在一定的p H 環境和變性條件下,細胞破裂,蛋白質變性沉淀,核酸被釋放到水相。上述變性條件可通過加熱、加入表面活性劑(SDS、Triton X-100 、Tween 20 、NP-40 、CTAB、sar-cosyl 、Chelex-100 等) 或強離子劑(異硫氰酸胍、鹽酸胍、肌酸胍) 而獲得。而p H 環境則由加入的強堿(NaOH) 或緩沖液 ( TE、STE 等) 提供。在一定的p H 環境下,表面活性劑或強離子劑可使細胞裂解、蛋白質和多糖沉淀,緩沖液中的一些金屬離子螯合劑( EDTA 等) 可螯合對核酸酶活性所必須的金屬離子Mg2+ 、Ca2+ ,從而抑制核酸酶的活性,保護核酸不被降解。

(3) 酶作用:主要是通過加入或蛋白酶(蛋白酶K、植物蛋白酶或鏈酶蛋白酶) 以使細胞破裂,核酸釋放。蛋白酶還能降解與核酸結合的蛋白質,促進核酸的分離。其中能催化細菌細胞壁的蛋白多糖N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸殘基間的β-(1 ,4) 鍵水解。蛋白酶K能催化水解多種多肽鍵,其在65 ℃及有EDTA、尿素(1～4mol/ L) 和去污劑(0. 5 %SDS 或 1 %Triton X-100) 存在時仍保留酶活性,這有利于提高對高分子量核酸的提取效率。在實際工作中,酶作用、機械作用、化學作用經常聯合使用。具體選擇哪種或哪幾種方法可根據細胞類型、待分離的核酸類型及后續實驗目的來確定。

2. 酶處理:在核酸提取過程中,可通過加入適當的酶使不需要的物質降解,以利于核酸的分離與純化。如在裂解液中加入蛋白酶(蛋白酶K 或鏈酶蛋白酶) 可以降解蛋白質,滅活核酸酶(DNase 和RNase) ,DNase 和RNase 也用于去除不需要的核酸。

3. 核酸的分離與純化:核酸的高電荷磷酸骨架使其比蛋白質、多糖、脂肪等其他生物大分子物質更具親水性,根據它們理化性質的差異,用選擇性沉淀、層析、密度梯度離心等方法可將核酸分離、純化。(1) 酚提取/ 沉淀法:核酸分離的一個經典方法是酚∶氯仿抽提法。細胞裂解后離心分離含核酸的水相,加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25 ∶24 ∶1 體積) 混合液。依據應用目的,兩相經漩渦振蕩混勻(適用于分離小分子量核酸) 或簡單顛倒混勻(適用于分離高分子量核酸) 后離心分離。疏水性的蛋白質被分配至有機相,核酸則被留于上層水相。酚是一種有機溶劑,預先要用STE 緩沖液飽和,因未飽和的酚會吸收水相而帶走一部分核酸。酚也易氧化發黃,而氧化的酚可引起核酸鏈中磷酸二酯鍵斷裂或使核酸鏈交聯;故在制備酚飽和液時要加入82羥基喹嚀,以防止酚氧化。氯仿可去除脂肪,使更多蛋白質變性,從而提高提取效率。異戊醇則可減少操作過程中產生的氣泡。核酸鹽可被一些有機溶劑沉淀,通過沉淀可濃縮核酸,改變核酸溶解緩沖液的種類以及去除某些雜質分子。典型的例子是在酚、氯仿抽提后用乙醇沉淀,在含核酸的水相中加入p H5. 0～5. 5 ,終濃度為0. 3M 的NaOAc 或KOAc 后,鈉離子會中和核酸磷酸骨架上的負電荷,在酸性環境中促進核酸的疏水復性。然后加入2～2. 5 倍體積的乙醇,經一定時間的孵育,可使核酸有效地沉淀。其他的一些有機溶劑[ 異丙醇、聚乙二醇( PEG) 等]和鹽類(10. 0mol/ L 醋酸銨、8. 0mol/ L 的氯化鋰、氯化鎂和低濃度的氯化鋅等) 也用于核酸的沉淀。不同的離子對一些酶有抑制作用或可影響核酸的沉淀和溶解, 在實際使用時應予以選擇。經離心收集,核酸沉淀用70 %的乙醇漂洗以除去多余的鹽分,即可獲得純化的核酸。(2) 層析法:層析法是利用不同物質某些理化性質的差異而建立的分離分析方法。包括吸附層析、親和層析、離子交換層析等方法在內的層析法。因分離和純化同步進行,并且有商品試劑盒供應,而被廣泛應用于核酸的純化。在一定的離子環境下,核酸可被選擇性地吸附到硅土、硅膠或玻璃表面而與其他生物分子分離。另外一些選擇性吸附方法以經修飾或包被的磁珠作為固相載體,磁珠可通過磁場分離而無需離心,結合至固相載體的核酸可用低鹽緩沖液或水洗脫。該法分離純化核酸,具有質量好、產量高、成本低、快速、簡便、節省人力以及易于實現自動化等優點。

玻璃粉或玻璃珠被證實為一種有效的核酸吸附劑。在高鹽溶液中,核酸可被吸附至玻璃基質上,離液鹽或高氯酸鈉可促進DNA 與玻璃基質的結合。Dederich 等用酸洗玻璃珠分離純化核酸,獲得高產量的質粒DNA。在該方法中,細胞在堿性環境下裂解,裂解液用緩沖液中和后,直接加至含異丙醇的玻璃珠濾板,被異丙醇沉淀的質粒DNA 結合至玻璃珠,用80 %乙醇真空抽洗除去細胞殘片和蛋白質沉淀。zui后用含RNase A 的TE 緩沖液洗脫與玻璃珠結合的DNA ,獲得的DNA 可直接用于測序。

Elkin 等使用羧化磁珠分離純化質粒DNA。該法在細胞裂解后,離心分離含質粒的水相,再加入羧化的磁粒,然后用 PEG/ NaCl 沉淀,使目的DNA 吸附至磁珠,zui后用磁場分離被吸附的DNA ,經乙醇洗滌,用水洗脫,可獲得高產量的適用于毛細管測序的模板DNA。

也有用鐵粒為固相支持物,經磁場分離而純化質粒DNA 的報道。細菌用2煮沸法裂解,質粒被釋放至懸浮液中, 加鐵珠捕獲,用磁場使鐵珠分離,經漂洗后用水洗脫質粒,可獲得高產量、測序級的質粒DNA。

親和層析是利用待分離物質與它們的特異性配體間所具有的特異性親和力來分離物質的一類層析方法。Chandler 等報道了一種用肽核酸(PNA) 分離核酸的方法。PNA 是一類以 N-(2-氨乙基)2結構單元為骨架的DNA 類似物,可作為純化皮克(pg) 級核糖體DNA ( rDNA) 和核糖體RNA ( rRNA) 的試劑。在該方法中,以標記的肽核酸(peptide nucleic acids ,PNAs) 為探針,以包被了抗生蛋白鏈菌素的磁珠作為固相載體。PNA 探針在高鹽環境下, 與目的核酸(DNA 或 RNA) 混合,經煮沸、冰浴、溫育雜交步驟后,直接加入包被了抗生蛋白鏈菌素的順磁性顆粒,經靜置捕獲PNA-核酸雜交體,水洗而獲得純化的核酸。

Schluep 等亦基于親和層析原理,采用一種三螺旋體DNA 的方式進行質粒DNA 的分離。三螺旋體DNA 由同質嘌呤2 同質嘧啶雙螺旋鏈與同質嘧啶單鏈組成,單鏈上的T 識別A ·T 堿基,對形成T ·A ·T 三聯體,質子化的單鏈胞嘧啶 (C+ ) 識別G·C 堿基對形成C ·G·C 三聯體。在適當的條件下,三螺旋體的結合具有高特異性和高穩定性。將配體聚嘧啶寡核苷酸鏈通過化學方法連接至Sephacryl S21000 SF 顆粒上形成親和載體。當含目的序列的質粒DNA 溶液與其混合時,在酸性環境(p H 4. 5～5. 5) 下,質粒結合至親和載體顆粒上,溶液中高濃度的NaCl 可穩定三聯體形式并減少與蛋白質、細胞DNA 的非特異性結合。經一段時間反應后,顆粒懸浮液被加至一層析柱,用適當的洗脫液改變p H 值至堿性環境,可使三聯體解聚,質粒被洗脫。經該法分離質粒DNA ,質粒產量可達到加入量的62 %。

也有用Schizophyllan ( SPG) 制備親和層析柱分離純化 RNA 的報道。SPG是一種β21 ,32葡聚糖,在低溫下,含RNA 的流動相通過層析柱,Poly (C) 和poly (A) 與SPG通過氫鍵和疏水作用形成復合物而被吸附于柱上,然后通過改變緩沖液成分,將被吸附的RNA 洗脫。親和層析應用于核酸分離與純化的另一個例子是用oligo ( dT)2纖維素層析法從真核細胞總 RNA 中分離帶poly (A) 尾的mRNA。在該方法中,短鏈oligo (dT) 通過其52磷酸與纖維素的羥基共價結合而連接至纖維素介質上。當樣本經過oligo (dT) 柱時,mRNA 因其poly (A) 可與短鏈oligo (dT) 形成穩定的RNA2DNA 雜合鏈,而被連接到纖維素介質上,從而與其他RNA 分離。在適當的條件下(低鹽、加熱) ,poly (A) RNA 可被水洗脫而得以純化。

離子交換層析以具有離子交換性能的物質為固定相,其與流動相中的離子能進行可逆交換,從而能分離離子型化合物。用離子交換層析純化核酸是因為核酸為高負電荷的線性多聚陰離子,在低離子強度緩沖液中,利用目的核酸與陰離子交換柱上功能基質間的靜電反應,使帶負電荷的核酸結合到帶正電的基質上,雜質分子被洗脫。然后提高緩沖液的離子強度,將核酸從基質上洗脫,經異丙醇或乙醇沉淀即可獲得純化的核酸。該法適用于大規模核酸的純化。Ferreira 等用含0. 5 M NaCl 的TE 緩沖液平衡層析柱,加樣后用含1 M NaCl 的TE 緩沖液洗脫核酸,獲得了很好的分離效果。

(3) 密度梯度離心法:密度梯度離心也用于核酸的分離和分析。雙鏈DNA、單鏈DNA、RNA 和蛋白質具有不同的密度,因而可經密度梯度離心形式形成不同密度的純樣品區帶, 該法適用于大量核酸樣本的制備,其中氯化銫2溴化乙錠梯度平衡離心法被認為是純化大量質粒DNA 的方法。氯化銫是核酸密度梯度離心的標準介質,梯度液中的溴化乙錠與核酸結合,離心后形成的核酸區帶經紫外燈照射,產生熒光而被檢測,用注射針頭穿刺回收后,通過透析或乙醇沉淀除去氯化銫而獲得純化的核酸。

展望

隨著“后基因組時代”的來臨,毛細管電泳等快速、的技術方法已廣泛應用于核酸分析。以前一些傳統的核酸提取方法因操作繁瑣、提取效率低、費時費力或使用有毒的化學試劑且不易于實現自動化儀器操作等原因,已不適應分子生物技術的發展要求。隨著人們的努力和技術的進步,相信一定會出現更多簡便、安全、、低成本且適用于自動化儀器操作新的核酸分離與純化方法,從而更快地推動分子生物學的發展。