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抗體
生物試劑
細胞
菌株
血清
細胞分離試劑
試劑盒

DNA序列分析(Sanger酶法)

時間:2017/7/10閱讀:1176
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一、試劑 
1 、 10 × TBE ( pH 8.3 ): 
2 、 46% 尿素溶液: 
3 、 20% 聚丙烯酰胺溶液 
4 、 10% 過硫酸胺 
5 、引物 
6 、模板 
7 、 DNA 聚合酶 
8 、放射性標記的 dNTP 和 ddNTP 貯存液 
9、TEMED 
二、操作方法 
(一)由雙鏈質(zhì)粒制備單鏈DNA膜板 
取質(zhì)粒 DNA (溶于雙離蒸去離子水中) 8μl ( 1.5 ~ 2ug ) 
↓ 
加 2mol NaOH 2ul ,混勻后稍加離心,置室溫 10min 
↓ 
加 3mol 乙酸鈉( pH5.2 ) 3μl 
雙蒸去離子水 7μl 
無水乙醇 60μl 
↓ 
置液氮 10min ,離心 10min ( 13krpm ), 
↓ 
加 70%乙醇洗1次,離心 ( 13krpm ) 
↓ 
棄上清,真空抽干,溶于 10ul雙 蒸去離子水中 
↓ 
取樣,電泳鑒定 
(二)聚丙烯酰胺/尿素膠制備: 
將玻板洗凈,拭干; 70% 乙醇洗,涼干;內(nèi)層涂硅油, 
重蒸水洗凈,吹干 
↓ 
混合: 20% 聚丙烯酰胺液 20ml 
10 × TBE 5ml 
46%尿素 25ml 
總計40ml過濾紙濾過 
↓ 
加 10%過硫酸胺(AP)250μl;用雙蒸去離子水定容至100ml,混勻 
↓ 
倒膠前加入 TEMED 50μl,混勻 
↓ 
灌膠,待凝膠聚合后,將測序膠板安裝于測序電泳槽中 
↓ 
電泳槽中加入 800ml1 × TBE 
↓ 
預電泳

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