一、實驗目的
通過實驗,掌握姐妹染色單體分染技術。
二、實驗原理
姐妹染色單體交換是近年來細胞遺傳學研究的一個新方法。其原理是,當細胞接觸到5-溴脫氧核苷(Brdu)時,Brdu可作為核苷酸前體物,專一替代胸腺嘧啶摻入到新合成的DNA鏈中。只要通過兩個細胞復制周期,就可使姐妹染色單體中的一條單體的DNA雙鏈中,有一股鏈是摻入有Brdu的,而另一條單體的DNA雙鏈中,兩股鏈全摻入有Brdu.這樣的細胞經過分化染色處理,即可見到同一條染色體的兩條姐妹染色單體有明顯的差異,有一條單體為深色,另一條為淺色。
三、實驗材料
體重為20~30克左右的純小白鼠,蠶豆種子。
四、實驗器具和藥品試劑
顯微鏡、冰箱、水浴鍋、天平、離心機、剪刀、鑷子、注射器、吸管、離心管、載片、量筒、燒杯、紫外燈、大培養皿。
秋水仙素 、5-溴脫氧尿苷、液體石蠟、檸檬酸鈉、氯化鉀、2×SSC溶液、磷酸緩沖液、鹽酸、Giemsa 原液。
五、實驗方法和步驟
(一)動物實驗法
1.稱100mg Brdu用5ml液體石蠟在小燒杯內混勻,冰箱保存備用。
2.用2ml注射器(8號針頭)吸取藥液,按每克體重注射1mg的量注入小鼠右腋皮下或腹腔內。
3.注射56小時后,按5ug/克的量注射秋水仙素溶液。
4.4小時后處死動物,取出大腿骨和脛骨。
5.按“小白鼠染色體的制備與觀察”實驗的方法制備染色體標本。
6.將染色體標本放入37℃溫箱內處理24小時。
7.在恒溫水浴鍋(48℃)內放一大培養皿,把標本片分放在皿內,上復一張擦鏡紙,滴加適量的2×SSC溶液,用15W紫外燈照射30分鐘,燈管距離標本片約6厘米。
8.照射完畢以蒸餾水或磷酸緩沖液沖去標本上的2×SSC溶液。
9.用3%Giemsa 染液染色10分鐘。
10.清水沖洗,片干后鏡檢。
(二)植物實驗法
1.選取當年的蠶豆種子,經水泡脹后,轉入20℃溫箱培養。 當主根長至3cm時,剪去根尖生長點,以利于長出更多的側根。
2.當大多數側根長至0.5cm時,用盛有5×10-4M Brdu溶液的小瓶,繼續在20℃黑暗條件下處理側根24~36小時。
3.切取側根根尖(0.5cm)浸入0.05%的秋水仙素溶液中預處理3.5~4小時。
4.用卡諾氏液固定3~24小時。
5.將根尖放在1N HCL 60℃條件下水解10分鐘。
6.經水洗后用席夫試劑染色30分鐘。
7.取一著色的根尖,放在載片上,加一滴45%醋酸,蓋上蓋片,用鑷子或橡皮頭鉛筆將材料敲呈一薄霧狀。
8.選擇分散的中期分裂相細胞,在高倍鏡下可看到姐妹染色單體間呈現明顯的深淺差別。深染的是BB-染色單體,淺染的是BT-染色單體。部分染色體上出現姐妹染色單體互換。凡染色單體端部出現的交換計為1個SCE,中部出現的計為兩個SCE。