同工酶是指能催化同一種化學反應, 但其酶蛋白本身的分子結構組成卻有所不同的一組 酶。它們是 DNA編碼的遺傳信息表達的結果。zui近的研究表明,同工酶與生物的遺傳、生 長發、代謝調節及抗性等都有一定的關系。因此,測定同工酶在理論上和實踐上都有重要的 意義。用聚丙烯酰胺凝膠電泳測定同工酶,方法簡便、靈敏度高,重現性強,測定結果便于 觀察、記錄和保存。
過氧化物酶是植物體內普遍存在的、活性較高的一種酶。它與呼吸作用、光合作用及生 長素的氧化等都有關系。在植物生長發育過程中它的活性不斷發生變化。因此,測定這種酶 的活性或其同工酶的變化情況,可以反映某一時期植物體內代謝的變化。
本實驗采用聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳技術,分離小麥幼苗過氧化物酶同工酶,根據酶 的生物化學反映,通過染色方法顯示出酶的不同區帶,以鑒定小麥幼苗過氧化物酶同工酶。 通過本實驗,主要要掌握電泳技術的原理、方法、設計、裝置、凝膠配制等問題,熟悉所有 的操作過程,另外,對同工酶有一個感性的認識。
二、原理
1.電泳現象
帶電粒子在電場中向與其自身帶相反電荷的電極移動,這種現象稱為電泳。 由于帶電膠粒或分子中各種成份,所具有的電荷和分子量不同,在電場中將以不同的速 度移動,因而在電泳進行過程中,不同的成份將按照各自的遷移速度得到有效的分離。
2.影響電泳的主要因素
若將帶凈電荷 q 的粒子放入電場,則該粒子所受到的引力 F 引可用數學式表示如下:
F 引 =E q (1)
式中 E 為電場強度,單位為“伏特/厘米” ,表示電場中單位距離上的電位差。 如果這種情況發生在真空中,則帶電粒子會朝著電極加速前進并且zui后與電極相撞。 但 在溶液中,由于電場的牽引力 F 引與加速運動的粒子和溶液之間產生的阻力(即摩擦力)F 阻 相對抗,故上述現象不會發生。根本 Stokes 公式,阻力的大小取決于粒子的大小和形狀以 及所在介質的粘度:
F 阻 = 6pghn (2)
式中 F 阻是球形粒子所受的阻力,g是球形粒子的半徑,h是溶液的粘度,n是粒子移動 的速度。在溶液中,由電場而產生的加速力被阻力所對抗,因此: E q = 6pghn (3) 整理一下:
pgm n 6 q E = (4)
由此可以看出,粒子移動的速度(n)與電場強度(E)和粒子所帶電荷量(q) 成正比, 而與粒子的大小(g)和溶液的粘度(h)成反比。不難想象,非球形粒子(如 DNA)在電泳過程中會受到更大的阻力,即粒子的移動速度還與粒子的形狀有關。 即然在一定 pH 條件下,每一分子都具有特殊的電荷(種類與數量)及大小和形狀,那 么在一定的時間內它在相同的電場中便應集中到*的位置上而形成緊密的泳動帶。 這就是 帶電粒子可以用電泳技術進行分離、分析、鑒定的基本原理。