目的:學習利用細菌檢測基因突變的方法
Ames試驗 即鼠傷營養缺陷型回復突變試驗,是目前檢測基因突變zui常用方法之一。
原理:利用鼠傷突變株,即缺陷型,其原始菌株菌體內的是通過自身一系列酶催化反應合成的,這種能自身合成所需營養成份的菌株叫做野生型菌株。本試驗用鼠傷為突變株,其不能合成,而必須由外界提供這種菌珠被稱為營養缺陷式營養實變型(his-)。當誘變劑作用于菌株后,在菌株遺傳物質的特定位點發生基因回復突變成為野生型(his+),故在缺乏的培養基上,只存少數自發回變菌落生長,而能誘發細菌回變的致突變物可使細菌生長增多,從而可判斷被藥物是否具有致實變性。
材料:菌株,鼠傷TA97,TA98,TA100,TA102。
器材:恒溫培養箱,干燥箱,高壓消毒鍋,水溶鍋,紫外線燈(15w),藥物天平,分析天平 酒精燈,濾紙片,平皿,試管,燒杯,吸管。
培養基配制
1.Vogel-Bonner液10×(VB液10倍濃縮)用于配制底層基本培養基。配制方法:(MgSO4·7H2O)1g,檸檬酸(C6H8O7·H2O)10g,(K2HPO4·3H2O)65.5g,磷酸氫銨鈉(NaNH4HPO4·4H2O)17.5g。將上述成分依次用蒸餾水溶解、混勻,然后加蒸餾水至500ml,置4℃冰箱保存。
2.底層基本培養基 取VB液(10倍)100ml,加入蒸餾水800ml,用1mol/L NaOH調pH至7.0,然后加入瓊脂12—15g,經121℃20分鐘高壓滅菌。待冷至800C左右時,加入100ml已經112℃20分鐘高壓滅菌的20%葡萄糖液,混勻后澆制平板。
3.上層培養基 D-12.4mg,L-鹽酸9.5mg,NaCl5g,瓊脂6g,上述成分依次加熱溶解,混合,然后加蒸餾水至1000ml。分裝后經121℃15分鐘高壓滅菌備用。
方法
1.藥物的劑量選擇
對于易溶解的藥物,實驗zui高劑量可采用抑菌濃度下的zui大劑量,或以zui大溶解度為zui高劑量和5mg/皿為zui高劑量,下設5個劑量,(即5000,500,50,5,0.5,0.1μg/皿)。溶劑:藥物是水溶性,可用滅菌蒸餾水,如非水溶性可選二甲亞砜為溶劑。
2.平板摻入法
每皿加底層培養20~25ml,待凝固。取融化并保溫于45℃的上層培養基,分裝于5ml試管中,每支試管2ml,依次加入新鮮菌液0.1ml, 藥物0.1ml,需加S9時則加入S9混合液0.3ml,混勻,迅速倒在底層培養基上,使之分布均勻。待上層瓊脂凝固后,翻轉平板置37℃培養48小時后,觀察結果。
結果評價
觀察結果時,首先應觀察各實驗組和陰性對照的背景菌苔的生長情況。在肯定背景菌苔與陰性對照相差不多后,再比較各劑量組的回變菌落數。若回變菌落數的出現有劑量反應關系,回變菌落數大于自發對照的2倍或以上,結果并具有重現性,并有統計學意義的增加,可判斷為陽性,反之為陰性。