材料、試劑及器具
1、 材料
總rna提取物。
2、 試劑
(1)0.1%DEPC水:200ml雙蒸去離子水加0.2mlDEPC焦炭酸、二乙酯混勻,室溫放置過夜,高壓滅菌。
(2)10x電泳緩沖液。
嗎啉代丙烷磺酸(MOPS) 0.4mol/L(pH 7.0)
NaAc 0.1mol/L
乙二胺四乙酸(EDTA) 10mmol/L
(3)50mL變性瓊脂糖凝膠(1%)
(4)10x電泳緩沖液 5 mL
瓊脂糖 0.5 g
0.1%DEPC水 36.5 mL
加熱溶解,稍冷卻,加入8.5 mL 37%甲醛。
(5)上樣緩沖液:50%,1mmmol/LEDTA,0.4% 溴酚蘭,0.4%二甲苯藍。
(6)甲酰胺(去離子)。
3、器具
(1)電泳系統
(2)紫外透視儀
RNA瓊脂糖凝膠電泳實驗原理、試劑配制方法及操作流程
四、操作步驟
1、 將制膠用具用70%乙醇沖洗一遍,晾干備用。
2、 制膠:
稱取0.5g瓊脂糖粉末,加入放有36.5mL的DEPC水的錐形瓶中,加熱使瓊脂糖*溶解。稍冷卻后加入5mL的10x電泳緩沖液、8.5mL的甲醛。然后在膠槽中灌制凝膠,插好梳子,水平放置待凝固后使用。
3、 加樣:
在一個潔凈的小離心管中混合以下試劑:電泳緩沖液(10x)2μl、甲醛3.5mL、甲酰胺10mL、RNA樣品3.5μl?;靹颍?0℃保溫10min,冰上速冷。加入3μl的上樣緩沖液混勻,取適量加樣于凝膠點樣孔內。同時點RNA標準樣品。
4、 電泳:
打開電泳儀,穩壓7.5V/cm電泳。
5、 電泳結束后通過紫外透視儀觀察。
五、注意事項
本實驗中必務必要去除RNase污染,防止RNA降解。所有試劑和器具需要用DEPC水配制和處理,并滅菌。此外可通過18s rRNA、28s rRNA、5s rRNA的三條帶的亮度判定RNA的完整性。