士鋒生物酵母感受態細胞的制備方法

時間：2014/2/11閱讀：785

酵母感受態細胞制備可以：(1)用于建立酵母轉化體系;(2)用于酵母表達系統構建;(3)用于酵母其他分子生物學研究。
一、試劑與耗材
1. 試劑
細菌用-酵母提取物、細菌用-蛋白胨、葡萄糖、細菌用-瓊脂粉、去離子水、、二甲基亞砜)、聚乙二醇3350(、醋酸鋰、鮭魚精子細胞DNA、酵母無氨基酸氮源(Sigma)、 2-(N-嗎啉代) 乙磺酸、腺嘌呤()、葡萄糖。
2. 儀器
水浴鍋(VWR)、離心機(eppendorf)、30 °C搖床與恒溫培養箱(VWR)、培養皿。
二、試劑配方
1. YPDA液體或固體培養基
(1)1%酵母提取物： 10 g/L
(2)2%胰蛋白胨： 20 g/L
(3)2%葡萄糖：20 g/L
2. 轉化液
(1)聚乙二醇3350(50 % (w/v)：260 μl
(2)1 M醋酸鋰：36 μl
(3)SsDNA(10 mg/ml)：10 μl
(4)質粒：3 μl
(5)總計：360 μl
3. YNB+ MA 培養基(100 ml)
(1)YNB：0.67 g
(2)2-(N-嗎啉代) 乙磺酸(20mM )：0.39 g
(3)腺嘌呤：0.01 g
(4)瓊脂粉：2g
(5)葡萄糖：2g
三、制備步驟
1. 在轉化實驗的兩天前，于YPDA培養基的平皿上活化酵母菌株。
2. 轉化前一天，挑取活化的酵母細胞(單克隆)于YPDA液體培養基中，30°C，200 rpm培養過夜。
3. 將培養過夜的酵母細胞液按1：3的比例轉接與新的YPDA液體培養基中，于30°C搖床內，200 rpm培養4 h。
4. 3 000 g 離心 5分鐘收集酵母細胞，用0.5倍體積的無菌水洗酵母細胞。
5. 再次3 000 g 離心 5分鐘。
6. 用0.01倍體積的無菌水重懸酵母細胞，并轉入適宜的離心管中，20°C ，3 000 g 離心 5分鐘。
7. 用0.01倍體積的無菌細胞懸浮液(5 % v/v ，10% v/v 二甲基亞砜)重懸酵母細胞。
8. 將重懸的酵母細胞按50 ul分裝到1.5 ml離心管中。
9. 將管放入塑料盒或者紙盒中(逐步梯度冷凍能夠增強酵母的存活率)。
10. 將裝有酵母細胞的盒子放入-80°C冰箱。(細胞在-80°C能夠保存一年以上)。

日韩午夜在线观看,色偷偷伊人,免费一级毛片不卡不收费,日韩午夜在线视频不卡片

士鋒生物酵母感受態細胞的制備方法

會員登錄

收藏該商鋪

提示