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士鋒生物三種方法檢測IL-4活性

時間:2014/1/20閱讀:1243
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IL-4可作為B細胞增殖的促進因子,1982年在T細胞培養上清中被發現,1986年被成功克隆,并統一命名為白細胞介素4。IL-4除了可作為腫瘤免疫調節劑外,近來還發現可能其可能為敗血癥休克的治療提供一個新的靶點。
1982年Howard在T細胞培養上清中發現一種促進B細胞增殖的因子, 起初命名為B細胞生長因子-1 (B cell growth factor-1, BCGF-1)。有的實驗室稱為B細胞刺激因子-1 (B cell stimulating factor-1, BSF-1)、T細胞生長因子-2 (T cell growth factor-2, TCGF-2)。1986年基因克隆成功,統一命名為白細胞介素4(interleukin 4, IL-4)。 IL-4對于B細胞、T細胞、肥大細胞、巨噬細胞和造細胞都有免疫調節作用。
人類IL-4主要由活化T細胞產生。在小鼠由Th2亞群產生。人與鼠IL-4 DNA水平上有70%同源性, IL-4前體蛋白從N 端到91位氨基酸以及C 端到128位氨基酸人小鼠之間在氨基酸水平上有70%同源性,前體蛋白91至128位氨基酸之間很少有同源性,這可能與IL-4種屬作用特異性有關,如人、 鼠IL-4生物學作用上沒有交叉反應。
IL-4生物活性的檢測方法:
1)用人外周血淋巴細胞檢測人IL-4
1.用淋巴細胞分離液分離人外周血單個核細胞(PBMC)。用預溫的RPMI-1640培養液洗滌細胞兩次,每次離心400×g 10分鐘,去上清液。
2.用含5%小牛血清和1%(v/v)PHA的RPMI-1640培養液將細胞稀釋至5×106/ml。在37℃ 5% CO2的飽和水汽二氧化碳培養箱中培養48小時。加等量含5%小牛血清的RPMI-1640培養液到細胞培養瓶中,再加20U/ml IL-2,繼續培養48小時。
3.用RPMI-1640培養液洗滌細胞兩次,每次離心250×g 10分鐘,去上清液。用含5%小牛血清和1%(v/v)PHA的RPMI-1640培養液將細胞稀釋至2×105/ml。以每孔0.1ml將細胞懸液加入96孔細胞培養板的各孔。
4.倍比稀釋IL-4標準品或待測樣品,標準IL-4從100ng/ml稀釋到0.1pg/ml(共12個稀釋度)。每孔加0.1ml稀釋樣品,每個稀釋度三個復孔,陰性對照孔不加IL-4。
5.在37℃ 5% CO2飽和水汽二氧化碳培養箱中培養細胞48小時。
6.每孔加0.5μCi(18.5kBq)[3H]脫氧胸苷,繼續培養18小時。
7.用多頭細胞收集器將細胞收集到玻璃纖維濾紙上,液體閃爍計數儀計數細胞攝入的同位素活性,用cpm值對樣品稀釋倍數作圖。比較標準品和待測樣品的50%zui大cpm值處的不同稀釋倍數,決定待測樣品的相應濃度。亦可用MTT檢測法。
2)檢測IL-4抑制細胞增殖的活性
1.CCL-185細胞的培養:培養CCL-185細胞的培養液是含10%小牛血清、和的HAMs F12K培養液,將細胞置37℃ 5% CO2的飽和水汽二氧化碳培養箱中培養至2×105/ml時分瓶到5×104/ml,繼續培養。
2.用CCL-185細胞檢測IL-4的生長抑制活性:
1)用上述細胞培養液倍比稀釋待測樣品的IL-4標準品,在96孔細胞培養板中每孔加入0.1ml稀釋液,每個稀釋度復孔2~3個。對照孔只加0.1ml培養液。
2)用細胞培養液洗滌CCL-185細胞后,將細胞配成1×105/ml懸液。每孔加0.1ml細胞懸液,置37℃ 5% CO2的飽和水汽二氧化碳培養箱中培養16小時。
3)每孔加0.5μCi(18.5kBq)[3H]脫氧胸苷,繼續培養4小時。
4)用多頭細胞收集器將細胞收集到玻璃纖維濾紙上,在液體閃爍儀上計數細胞攝入的同位素活性,用cpm值對樣品稀釋倍數作圖。在圖上,標準IL-4的曲線與待測樣品的曲線應當呈平行的S型。比較同樣cpm處的不同稀釋倍數,決定待測樣品的相應濃度。
3)用B細胞增殖反應檢測IL-4
1.制備部分純化的B細胞:取BALB/c或C57BL/6小鼠,無菌分離脾細胞。去除粘附細胞和T細胞,分離部分純化的B細胞。洗滌細胞后,用細胞培養液將細胞培養液將細胞配成1×106~2×106/ml。
2.確定抗IgM抗體的亞適劑量
1)取96孔細胞培養板,每孔加0.1ml B細胞懸液,加0.5U重組IL-4。
2)用細胞培養液系列稀釋抗IgM抗體,每孔加0.1ml稀釋液。每個稀釋度設2~3個復孔。對照孔只加細胞培養液。
3)置37℃ 5% CO2的飽和水汽二氧化碳培養箱中培養48~72小時。用[3H]脫氧胸苷摻入法或MTT法測定細胞增殖率。與對照相比,取加入IL-4后能引起明顯細胞增殖的zui低或接近zui低的抗IgM抗體的稀釋度為亞適劑量。
3.協同刺激實驗
1)取96孔細胞培養板,每孔加0.1ml B細胞懸液和0.05ml亞適劑量的抗IgM抗體。
2)用細胞培養液系列稀釋IL-4標準品和待測樣品,每孔加0.05ml稀釋液。每個稀釋度設2~3個復孔。對照孔只加細胞培養液。
3)置37℃ 5% CO2的飽和水汽二氧化碳培養箱中培養48~72小時。用[3H]脫氧胸苷摻入法或MTT法測定細胞增殖率。
IL-4生物活性的檢測方法包括了人外周血淋巴細胞檢測、抑制細胞增殖的活性檢測和B細胞增殖反應,另外由IL-4介導還能使腫瘤本身cathepsin B和cathepsin S活性增強,已成為的研究熱點之一。

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