蛋白質組研究的發展以雙向電泳技術作為核心.雙向電泳由O’Farrell’s于1975年建立并成功地分離約1 000個E.coli蛋白,并表明蛋白質譜不是穩定的,而是隨環境而變化.雙向電泳原理簡明,*向進行等電聚焦,蛋白質沿pH梯度分離,至各自的等電點;隨后,再沿垂直的方向進行分子量的分離.目前,隨著技術的飛速發展,已能分離出10 000個斑點（spot）.當雙向電泳斑點的全面分析成為現實的時候,蛋白質組的分析變得可行.

樣品制備（sample prepareation）和溶解同樣事關2-DE的成效,目標是盡可能擴大其溶解度和解聚,以提高分辨率.用化學法和機械裂解法破碎以盡可能溶解和解聚蛋白,兩者聯合有協同作用.對IEF（isoelectric focusing）樣品的預處理涉及溶解、變性和還原來*破壞蛋白間的相互作用,并除去如核酸等非蛋白物質.理想的狀態是人們應一步完成蛋白的*處理.而離液劑2 mol/L硫脲和表面活性劑4%CHAPS的混合液促使疏水蛋白從IPG（immobilized pH gradients）膠上的轉換.三丁基膦（Tributyl phosphine,TBP ）取代β-巰基乙醇或DTT*溶解鏈間或鏈內的二硫鍵,增強了蛋白的溶解度,并導致轉至第二向的增加].兩者通過不同的方法來增加蛋白的溶解度,作為互補試劑會更有效.在保持樣品的完整性的前提下,可利用超離和核酸內切酶去除核酸（DNA）.除此之外,機械力被用來對蛋白分子解聚,如超聲破碎等.另外,添加PMSF等蛋白酶抑制劑,可保持蛋白完整性.由于商品化的IPG膠條是干燥脫水的,可在其水化的過程中加樣,覆蓋整個IPG膠,避免在樣品杯中的沉淀所致的樣品丟失].此外,低豐度蛋白（low abundance protein）在細胞內可能具有重要的調節功能,代表蛋白質組研究的“冰山之尖”,故分離低豐度蛋白是一種挑戰.亞細胞分級和蛋白質預分級、提高加樣量（已達到1～15 mg級的標準）、應用敏感性檢測,可以提高其敏感性.如一種多肽免疫2-DE印跡（MI-2DE）是利用幾種單克隆抗體技術來分析和檢測.提高組蛋白和核糖體蛋白等堿性蛋白（basic proteins）的分離是另一難點.由于堿性pH范圍內凝膠基質的不穩定及逆向電滲流（EOF）的產生,對PI（等電點）超過10的堿性蛋白,通過產生?0～10%?的梯度和16%的異丙醇可減少之.亦可用雙甲基丙烯酰胺來增加基質的穩定性.?

2-DE面臨的挑戰是高分辨率和重復性.高分辨率確保蛋白zui大程度的分離,高重復性允許進行凝膠間配比（match）.對2-DE而言,有3種方法分離蛋白:1）ISO-DALT（isoelectric focus）以O’Farrell’s技術為基礎.*向應用載體兩性電解質（carrier ampholyte, CA）,在管膠內建立pH梯度.隨著聚焦時間的延長,pH梯度不穩,易產生陰極漂移.2） NEPHGE（non-equilibrium pH gradient electrophoresis）用于分離堿性蛋白（pH>7.0）.如果聚焦達到平衡狀態,堿性蛋白會離開凝膠基質而丟失.因此,在等電區域的遷移須在平衡狀態之前完成,但很難控制.3）IPG-DALT發展于80年代早期.由于固相pH梯度（Immobilized pH gradient, IPG）的出現解決了pH梯度不穩的問題.IPG通過immobiline共價偶聯于丙烯酰胺產生固定的pH梯度,克服了IEF的缺點,從而達到高度的重復性.目前可以制作線性、漸進性和S型曲線,范圍或寬或窄的pH梯度.新的酸性pH 3～5或堿性pH 6～11的IPG凝膠梯度聯合商品化的pH 4～7的梯度可對蛋白質形成蛋白質組重疊群（proteomic contigs）從而有效分離.

分離后的斑點檢測（spot detection）亦很重要.所采用的檢測策略和分離后所采用的方法的相互作用是很重要的.此外,還需考慮反應的線性、飽和閾/動態范圍、敏感性、對細胞蛋白群的全體定量分析的適應性、可行性.目前,沒有一種蛋白染色覆蓋廣泛的濃度和PI及分離后分析技術.銀染已成為一種檢測2-DE的流行方法,可檢測少到2～5ng的蛋白,因此較考馬斯亮藍R-250敏感.多數糖蛋白不能被考馬斯亮藍染色,一些有機染料不適于PVDF膜.放射性標記不依賴其代謝的活性,并僅適于對合成的蛋白質檢測.另有一種改良的2-DE（差異凝膠電泳）,即應用兩種不同的染料熒光標記兩個樣品,使在同一凝膠上電泳后的凝膠圖象為兩個,避免了幾種2-DE的比較,可在納克級進行檢測.

較早期相比,2-DE有兩個主要的進步:首先,*的重復性使有機體的參考圖譜,可通過Internet獲得,來比較不同組織類型、不同狀態的基因表達;其次,高加樣量使得2-DE成為一項真正的制備型技術.