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技術講解:ELISPOT技術原理介紹

時間:2013/7/27閱讀:848
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一、elispot.html' target='_blank'>ELISPOT 技術簡介

隨著酶聯免疫分析技術在醫學及生物學領域的廣泛應用, 使體外檢測各種細胞因子及抗體研究有了新的突破。在研究免疫應答機制時以往常用用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測體液中游離的細胞因子(CK)或抗體,但由于游離的循環抗體或 CK 的半哀期不同,使之在體液中不斷的被代謝或與靶器官結合,而不能確切的反映體內的抗體及CK 的水平。80 年代,國外的科研工作者根據 ELISA 技術的基本原理,建立了體外檢測特異性抗體分泌細胞和 CK 分泌細胞的固相酶聯免疫斑點技術(ELISPOT)。因其具有較高的特異性和敏感性,目前正被國內外廣泛應用,對探索自身免疫系統疾病發病機制具有重要意義。

ELISPOT 法源自ELISA ,又突破傳統ELISA 法,是定量ELISA 技術的延伸和新的發展。兩者都是檢測細胞產生的細胞因子或其他可溶性蛋白,它們zui大的不同在于:

1、ELISA 通過顯色反應,在酶標儀上測定吸光度,與標準曲線比較得出可溶性蛋白總量。

2、ELISPOT 也是通過顯色反應,在細胞分泌這種可溶性蛋白的相應位置上顯現清晰可辨的斑點,可直接在顯微鏡下人工計數斑點或通過 CTL 公司的 ELISPOT 分析系統對斑點進行計數,1 個斑點代表 1 個細胞,從而計算出分泌該蛋白的細胞的頻率。(某些研究不僅要測細胞因子生成量,還需檢測分泌此細胞因子的細胞頻率)。

3、由于是單細胞水平檢測,ELISPOT 比 ELISA 和有限稀釋法等更靈敏,能從 20 萬 -30 萬細胞中檢出 1 個分泌該蛋白的細胞。

4、捕獲抗體為 BD 、R&D 、Mabtech 、Diaclone 生產的高親和力、高特異性、低內毒素單抗,在研究者以刺激劑激活細胞時,不會影響活化細胞分泌細胞因子。

二、ELISPOT 檢測原理

細胞受到刺激后局部產生細胞因子,此細胞因子被特異單克隆抗體捕獲。細胞分解后,被捕獲的細胞因子與標記的二抗結合,其后再與堿性磷酸酶標記的親和素結合。BCIP/NBT 底物孵育后,PVDF 孔板出現“紫色”的斑點表明細胞產生了細胞因子,通過 CTL 公司生產的 ELISPOT 酶聯斑點分析系統對斑點的分析后得出結果。

三、ELISPOT 分析儀的出現解決了以下問題

1、哪些斑點是抗原特異性T 細胞產生的(此斑點具有進一步分析價值),哪些是無關細胞產生的(此斑點沒有T 細胞研究價值)?

2、斑點大小的意義?

3、在對不同細胞因子計數和分析時,如何定義斑點zui大和zui小尺寸?

4、如何從單個細胞基礎上分析?

5、實驗度有多高?如果一個細胞產生相似的細胞因子,在多大程度上會干擾分析結果?6、幾次重復實驗才能使結果更有意義?

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