一、elispot.html' target='_blank'>ELISPOT 技術(shù)簡介
隨著酶聯(lián)免疫分析技術(shù)在醫(yī)學(xué)及生物學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用, 使體外檢測各種細(xì)胞因子及抗體研究有了新的突破。在研究免疫應(yīng)答機(jī)制時以往常用用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測體液中游離的細(xì)胞因子(CK)或抗體,但由于游離的循環(huán)抗體或 CK 的半哀期不同,使之在體液中不斷的被代謝或與靶器官結(jié)合,而不能確切的反映體內(nèi)的抗體及CK 的水平。80 年代,國外的科研工作者根據(jù) ELISA 技術(shù)的基本原理,建立了體外檢測特異性抗體分泌細(xì)胞和 CK 分泌細(xì)胞的固相酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)(ELISPOT)。因其具有較高的特異性和敏感性,目前正被國內(nèi)外廣泛應(yīng)用,對探索自身免疫系統(tǒng)疾病發(fā)病機(jī)制具有重要意義。
ELISPOT 法源自ELISA ,又突破傳統(tǒng)ELISA 法,是定量ELISA 技術(shù)的延伸和新的發(fā)展。兩者都是檢測細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子或其他可溶性蛋白,它們zui大的不同在于:
1、ELISA 通過顯色反應(yīng),在酶標(biāo)儀上測定吸光度,與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較得出可溶性蛋白總量。
2、ELISPOT 也是通過顯色反應(yīng),在細(xì)胞分泌這種可溶性蛋白的相應(yīng)位置上顯現(xiàn)清晰可辨的斑點,可直接在顯微鏡下人工計數(shù)斑點或通過 CTL 公司的 ELISPOT 分析系統(tǒng)對斑點進(jìn)行計數(shù),1 個斑點代表 1 個細(xì)胞,從而計算出分泌該蛋白的細(xì)胞的頻率。(某些研究不僅要測細(xì)胞因子生成量,還需檢測分泌此細(xì)胞因子的細(xì)胞頻率)。
3、由于是單細(xì)胞水平檢測,ELISPOT 比 ELISA 和有限稀釋法等更靈敏,能從 20 萬 -30 萬細(xì)胞中檢出 1 個分泌該蛋白的細(xì)胞。
4、捕獲抗體為 BD 、R&D 、Mabtech 、Diaclone 生產(chǎn)的高親和力、高特異性、低內(nèi)毒素單抗,在研究者以刺激劑激活細(xì)胞時,不會影響活化細(xì)胞分泌細(xì)胞因子。
二、ELISPOT 檢測原理
細(xì)胞受到刺激后局部產(chǎn)生細(xì)胞因子,此細(xì)胞因子被特異單克隆抗體捕獲。細(xì)胞分解后,被捕獲的細(xì)胞因子與標(biāo)記的二抗結(jié)合,其后再與堿性磷酸酶標(biāo)記的親和素結(jié)合。BCIP/NBT 底物孵育后,PVDF 孔板出現(xiàn)“紫色”的斑點表明細(xì)胞產(chǎn)生了細(xì)胞因子,通過 CTL 公司生產(chǎn)的 ELISPOT 酶聯(lián)斑點分析系統(tǒng)對斑點的分析后得出結(jié)果。
三、ELISPOT 分析儀的出現(xiàn)解決了以下問題
1、哪些斑點是抗原特異性T 細(xì)胞產(chǎn)生的(此斑點具有進(jìn)一步分析價值),哪些是無關(guān)細(xì)胞產(chǎn)生的(此斑點沒有T 細(xì)胞研究價值)?
2、斑點大小的意義?
3、在對不同細(xì)胞因子計數(shù)和分析時,如何定義斑點zui大和zui小尺寸?
4、如何從單個細(xì)胞基礎(chǔ)上分析?
5、實驗度有多高?如果一個細(xì)胞產(chǎn)生相似的細(xì)胞因子,在多大程度上會干擾分析結(jié)果?6、幾次重復(fù)實驗才能使結(jié)果更有意義?