支原體污染檢測試劑盒（PCR法）

（PCR Mycoplasma Detection Kit）

Cat number：YS012

Store at -20℃ for one year

Expire date：

For Research Use Only

----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

一、 試劑盒說明

本試劑盒通過PCR法對細胞培養物、動物分泌物等多種生物材料進行支原體污染檢測。常規培養法進行支原體檢測一般需要幾天的時間，而本試劑盒通過PCR擴增及電泳分析進行支原體檢測只需幾個小時，方便快捷。本試劑盒的多對引物能特異性擴增多種支原體rRNA基因片段，一次就可以檢測至少11種的支原體，包括M. fermentans，M. hyorhinis，M. arginini，M. orale，M. salivarium，M. hominis，M. pulmonis，M. arthritidis, M. neurolyticum, M. hyponeumoniae, M. capricolum 等。其原理是原核生物的rRNA堿基序列非常保守，而rRNA操縱子上編碼rRNA的DNA間隔區如16S和23S間隔區，各種生物種間的堿基序列差別很大。這個間隔區的DNA序列及長度在支原體各個種間既有相對保守的部分，也有具有很大差異的部分。因此可以在編碼16S和23S rRNA的DNA上設計一對引物，擴增編碼16S和23S rRNA的DNA間隔區，然后在編碼16S和23S rRNA的DNA間隔區的保守區上設計一條引物，在編碼23S rRNA的DNA上設計一條引物進行嵌套式PCR。能特異性檢測出支原體DNA，檢測靈敏度與特異性都很高。

二、試劑盒組份

三、試劑盒以外自備儀器和試劑

離心機、微量移液器、PCR儀、電泳儀、凝膠成像儀、dNTPs（10mM）、瓊脂糖、溴化乙錠等

四、使用注意事項

整個實驗，應規范操作，反應體系的配制、樣本處理及加樣、PCR擴增應分區域進行，以避免交叉污染。

五、 操作方法

1.收取待檢樣品（細胞一般生長至80％左右即可，貼壁細胞不宜用消化液消化細胞，可以使用細胞刮刮取細胞），然后取細胞懸液200ul（約1～3×105細胞數）至離心管，12000rpm離心5～10min；去上清，加入50ul DNA溶解液，充分懸浮沉淀物，沸水浴5min；樣品使用前12000rpm離心5～10min，取上清4ul作為PCR反應模板；剩余樣品可以-20℃保藏。樣本有時也可以直接用污染液直接做PCR反應。

2.PCR反應

*步PCR：

50μL體系PCR反應（如客戶需要使用更小量的反應體系，試劑加樣量按比例進行減少）：

（1）．使用前每個組份輕輕混勻，然后2000rpm離心20s；

（2）．取滅過菌的0.2mL離心管，在冰上依次加入

10×Taq Buffer                   5  μL

dNTPs （10mM）                  1  μL

MgCl2 （25mM）                  4  μL

Myc F1 （10μM）                 1  μL

Myc R1 （10μM）                 1  μL

DNA樣品                      1~5 μL

Taq DNA Polymerase             0.5 μL

ddH2O up to                     50 μL

（3）．輕輕混勻，2000rpm離心20s；

（4）．進行PCR擴增

PCR擴增條件：

94°C，5min；

94°C，30 sec；55°C，2min；72°C，1 min；32 Cycles；

72°C，10 min，

第二步PCR：

50μL體系PCR反應（如客戶需要使用更小量的反應體系，試劑加樣量按比例進行減少）：

（1）．使用前每個組份輕輕混勻，然后2000rpm離心20s；

（2）．取滅過菌的0.2mL離心管，在冰上依次加入

10×Taq Buffer                   5  μL 

dNTPs （10mM）                  1  μL

MgCl2 （25mM）                  4  μL

Myc F2 （10μM）                 1  μL

Myc R2 （10μM）                 1  μL

*步產物                    1~5 μL

Taq DNA Polymerase             0.5 μL

ddH2O up to                     50 μL

（3）．輕輕混勻，2000rpm離心20s；

（4）．進行PCR擴增

PCR擴增條件：

94°C，5min；

94°C，30 sec；55°C，2min；72°C，1 min；32 Cycles；

72°C，10 min，

3.反應結束后，取反應液10μL進行瓊脂糖凝膠電泳，確認PCR反應產物。如果此PCR產物需用于以后實驗，應將PCR產物冷凍保存。

4.根據感染支原體類型的不同，擴增產物大小有所不同，*步PCR產物在350～700bp 之間，第二步PCR產物在150～250bp之間。