熒光素標記精子發生相關的新基因抗體IgG相關知識

免疫檢測
一抗與靶蛋白的結合
① 封閉的膜用PBST漂洗2-3次。
② 將加樣槽洗滌干凈，用蒸餾水潤洗，晾干，將膜用一次性手套覆蓋好，按標記和實驗設計切下膜條（一般為3 mm寬左右）按順序置于加樣槽中，作好實驗記錄，加入相應的一抗約1ml，注意保證膜的所有部分同溶液接觸。
③ 室溫下于搖床孵育2h或4℃過夜。
④ 棄去一抗，膜條仍置于加樣槽，每個槽加2-3 mlPBST，上搖床洗滌洗滌5-10min ，換液，反復4次。
  酶標記二抗與一抗的結合
① 根據實驗需要和設計選擇合適的酶標二抗和稀釋濃度（用含0.5%脫脂奶粉的PBS稀釋），每個加樣槽中加入二抗1ml左右室溫下于搖床孵育1h或4℃過夜，注意保證膜的所有部分同溶液接觸。
②棄去二抗，膜條仍置于加樣槽，每個槽加2-3 mlPBST，上搖床洗滌洗滌5-10min ，換液，反復4次。

顯色反應（注：二抗一般有兩種常用標記酶，HRP和AP，其相對應的顯色底物試劑盒為DAB和BCIP/NBT）
① HRP標記二抗顯色
   用DAB KIT（KPL LOT NO YM107 CAT：54-10-00）顯色，按順序依次加Tris Buffer 3滴，DAB Substrate 3滴,Peroxide solution 2滴于5ml蒸餾水中，避光，混勻，將膜加入顯色液中避光顯色15 min左右終止反應，記錄實驗結果，將NC膜晾干掃描保存
②        AKP標記二抗顯色
   用AKP緩沖液洗膜5min，棄去AP緩沖液，加入顯色液（66µlNBT溶液同10mlAKP緩沖液充分混合均勻后加入33µl BCIP溶液1h內使用），室溫下顯色（37℃可加速反應），顯色反應通常在30min內可完成。用20mM EDTA/TBS洗膜終止反應,記錄實驗結果，將NC膜晾干掃描保存。反應溶液可預先配置，可在4℃儲存一年以上。