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DNA為基礎的方法檢測飼料中的動物源性成分
最近更新時間：2012-6-14
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以檢測DNA為基礎的方法主要有核酸探針雜交、DNA指紋分析、PCR-RFLP分析、PCR特異擴增（常規(guī)PCR方法和Real-time PCR方法）。其主要原理都是對各物種內(nèi)特異的核酸序列進行提取、鑒定，從而判定飼料內(nèi)有無該物種的成分，只是結(jié)果判別的信號條件不同。
核酸探針雜交方法的原理是堿基配對，即一條DNA鏈能與它的特異互補鏈配對形成雙鏈DNA。因此，用一個熒光物質(zhì)或放射性物質(zhì)標記的單鏈核苷酸探針能夠很快地從許多其他DNA分子的混合物中檢測出它的互補單鏈。由于雜交探針需要用熒光物質(zhì)或放射性物質(zhì)進行標記，所以該法在實際檢測中很少應用。
動物基因組中存在大量的分散重復序列（interspersedrepeat sequence，IRS），并且是種間高度特異的，DNA指紋分析就是通過用哺乳動物中廣泛存在的分散重復序列的特異引物進行PCR擴增，建立從牛到鴕鳥的30多種哺乳動物的DNA指紋圖譜，來對飼料中的動物源性成分的DNA進行鑒定。由于DNA指紋有一定難度，所以該法在實際檢測中也較少應用。
PCRRFLP（限制性內(nèi)切酶多態(tài)性分析）方法是用引物進行擴增，然后對擴增片段用限制性內(nèi)切進行酶切，利用限制性內(nèi)切酶的多態(tài)性進行檢測。由于使用的限制性內(nèi)切酶對PCR產(chǎn)物進行限制性內(nèi)切酶切分析不方便，所以該法在實際檢測中應用較少。
PCR特異擴增方法由于其簡單、快速、特異性強成為目前zui廣泛應用的方法，特別是熒光PCR（或稱為Real-timePCR）的應用使得檢測的特異性和敏感性更高。Tartaglia*次設計了PCR試驗，將其用于肉骨粉以及飼料中的反芻動物源性成分的檢測。他所選的目標片斷是線粒體DNA中編碼tRNAlys和ATP合成酶8亞基和6亞基的片段，高等植物中未發(fā)現(xiàn)其同源序列，采用異硫氰酸胍和二氧化硅方法提取DNA，肉骨粉的檢出的含量的zui低限為0．125％，我國的出入境檢驗檢疫系統(tǒng)根據(jù)該方法制定了檢測肉骨粉中牛源性、羊源性成分的行業(yè)標準。
但是，隨后對PCR方法的驗證發(fā)現(xiàn)這一方法有其缺陷，因為加工過程中的熱處理使得大量DNA被嚴重降解，分解成小片段，有數(shù)據(jù)表明當肉被加熱到100~C時，其中的DNA就被降解到1100bp至300bp左右。若設計的目的片段太長則可能無法擴增出來，這在許多人的報道中被證實。因此，需要設計比較小的目的片段，同時要選擇細胞內(nèi)含量比較多的目標片段。目前所建立的PCR方法中以線粒體DNA中的細胞色素b與tRNAlysATP合成酶亞基8和亞基6的片段為目標區(qū)域的較多，線粒體基因的其他部分（如D—loop區(qū)域），還有其他核酸序列（如衛(wèi)星DNA、actln基因、SINEs序列和LINEs序列、生長素基因等）也被作為檢測的目的基因。
線粒體編碼的長度為60-70bp的片段已經(jīng)被作為一些物種的目標片段進行檢測，由于這些片段比較小，用瓊脂糖電泳檢測非常不方便，但用熒光PCR檢測可以避免這些問題。Real—tmmPCR中使用的TaqMan技術(shù)是在引物的基礎上又添加了一條探針，只有在探針與擴增出的目標片段結(jié)合時，才發(fā)出熒光信號，可以根據(jù)發(fā)出的熒光對反應進行實時檢測，比經(jīng)典的PCR方法特異性高，這是因為有引物和探針對目標進行雙重篩選。有資料表明用這項技術(shù)對幾種動物成分進行了檢測，在所有樣品中動物的成分都可清楚地檢測到，這一結(jié)果說明，肉骨粉經(jīng)過加工后，即使溫度達到141~C，也有足夠的DNA可通過Real—time PCR技術(shù)檢測到，而當目標片段設計為275bp或350bp時，所有的樣品都檢測不到。同時對于目前的定性檢測，利用不同的探針和染料可以做到一個反應內(nèi)檢測多個動物品種。
PCR方法在檢測大多數(shù)生產(chǎn)條件下生產(chǎn)的飼料，至少在歐盟法定的條件下生產(chǎn)的肉骨粉是有效的，但生產(chǎn)過程的多樣性導致了基因物質(zhì)的不同降解水平，因此不同的生產(chǎn)條件都會對檢測結(jié)果產(chǎn)生影響，擴增的片段大小也會對檢測的靈敏度產(chǎn)生影響。PCR的缺點還表現(xiàn)在必須的刻防止交叉污染，并且這個方法無法檢測動物DNA的來源，因為肉骨粉的出現(xiàn)與陽性信號的出現(xiàn)并無直接關(guān)系，乳汁、血液、脂肪都有可能是DNA的來源。PCR方法相對來說是一種比較昂貴的方法，不僅試劑貴而且也需要比較昂貴的儀器，特別是熒光PCR儀。