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磺胺十五合一檢測試劑盒使用說明書

 1 原理及用途

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測組織、血清、蜂蜜、牛奶、雞蛋、飼料等樣本中的磺胺類藥物（Sulfonamides，SAs），試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標板、酶標記物、抗體、標準品及其他配套試劑組成。檢測時，加入標準品或樣品溶液，樣本中的磺胺類藥物和酶標板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競爭抗磺胺類藥物抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含磺胺類藥物含量成負相關(guān)，與標準曲線比較即可得出樣本中磺胺類藥物的殘留量。

2 技術(shù)指標

2.1 試劑盒靈敏度：0.5ppb(ng/ml)

2.2 反應(yīng)模式：25℃，45min～15min

2.3 檢測下限：

組織（高檢測限方法）……………………0.5ppb

組織（低檢測限方法）……………………5ppb

血清、尿液、雞蛋………………………2ppb

蜂蜜………………………………………0.5ppb

牛奶………………………………………10ppb

飼料………………………………………20ppb

2.4 交叉反應(yīng)率：

 2.5 樣本回收率：

組織、蜂蜜、雞蛋………………………………85±25%

尿樣、牛奶、血清、飼料………………………80±25%

3 試劑盒組成

酶標板……………………………96孔

標準液：各1ml

0ppb、0.5ppb、1.5ppb、4.5ppb、13.5ppb、40.5ppb

高標準液（紅蓋）：1ppm…………1ml

酶標記物（紅蓋）…………………5.5ml

抗體工作液（藍蓋）………………5.5ml

底物液A（白蓋）……………………6ml

底物液B（黑蓋）……………………6ml

終止液（黃蓋）………………………6ml

20X濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml

2X復(fù)溶液（黃蓋）…………………50ml

說明書………………………………1份

4 需要的器材和試劑

4.1 儀器：酶標儀、打印機、均質(zhì)器 、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）

4.2 微量移液器：單道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl

4.3 試劑：乙酸乙酯、正己烷、乙腈、Na2HPO4·12H2O、NaOH 、濃HCl、NaH2PO4·2H2O

5 樣本前處理

5.1 樣本處理前須知：

實驗器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實驗結(jié)果。

5.2 配液：

配液1：0.2M  磷酸鹽緩沖液

    稱取25.8g Na2HPO4·12H2O和4.4g NaH2PO4·2H2O加去離子水500ml溶解。

配液2:乙腈-乙酸乙酯溶液

    量取50ml乙腈和50ml乙酸乙酯加入100ml玻璃瓶中，混勻。

配液3：0.5M鹽酸溶液

    4.3ml濃HCL加入去離子水定容至100ml混勻。

配液4：0.2M  NaOH溶液

    0.8gNaOH用去離子水100ml溶解

配液5：復(fù)溶液

    將2×復(fù)溶液用去離子水2倍稀釋，用于樣本的復(fù)溶，復(fù)溶液在4℃環(huán)境可保存一個月。

5.3 樣本前處理步驟：

5.3.1 組織樣本（高檢測限）處理方法

1）稱取2±0.05g均質(zhì)組織樣本置離心管中，加入1ml 0.2M磷酸鹽緩沖溶液，用渦旋儀渦動樣本成糊狀，加入7ml乙腈-乙酸乙酯溶液，振蕩2min，室溫4000r/min以上離心5min；

2）移取4ml上層清澈有機相至干燥容器中，在50-60℃氮氣或空氣吹干；

3）加入1ml正己烷溶解干燥的殘留物，加入樣本復(fù)溶液1ml。振蕩混合30s，室溫4000r/min以上離心5min；

4）去除上層正己烷，取50µl下層水相用于分析。  

    樣本稀釋倍數(shù)：1    檢測下限：0.5ppb

5.3.2 組織樣本（低檢測限）處理方法

1）稱1.0±0.05g 均質(zhì)組織樣本于離心管中；加入9ml 0.2M PB緩沖液，震蕩5min，室溫4000r/min以上離心5min； 

2）取50µl上層液體用于分析。

    樣本稀釋倍數(shù): 10    檢測下限： 5ppb  

5.3.3 雞蛋樣本處理方法

1）用均質(zhì)器均質(zhì)雞蛋樣本，使蛋清和蛋黃充分混合；

2）稱取2.0±0.05g均質(zhì)后的雞蛋樣本（蛋粉1g加3ml去離子水混勻后取2ml相當于2g鮮雞蛋）至50ml離心管中，加入8ml乙腈，立即用振蕩器振蕩10min，室溫4000r/min以上離心5min；

3）移取1ml上清液至10ml潔凈干燥玻璃試管中于，在50-60℃氮氣或空氣吹干；

4）加入1ml正己烷，用渦旋儀渦動30s溶解干燥的殘留物，再加入1ml復(fù)溶工作液，用渦旋儀渦動1min，室溫4000r/min以上離心5min；

5）去上層有機相，取下層水相50ul用于分析。

    樣本稀釋倍數(shù): 4    檢測下限：2ppb  

5.3.4 血清樣本處理方法 

1）將血樣本于室溫放置30min，室溫4000r/min以上離心10min，分離出血清或過濾血清；

2）取1ml血清，加入3ml 0.2M PB緩沖液混合，混合30s；

3）取50µl用于分析。  

    樣本稀釋倍數(shù)：4    檢測下限：2ppb　　

5.3.5 蜂蜜樣本處理方法

1）稱取1±0.05g蜂蜜樣本于50ml離心管中，加入1ml 0.5M鹽酸置于37℃環(huán)境中30min；

2）加入2.5ml 0.2M 氫氧化鈉 (將PH值調(diào)至5左右)再加入4ml乙酸乙脂振蕩5min，4000r/min以上室溫離心5min；

3）取2ml上層液體于50℃下氮氣吹干，加0.5ml 已稀釋好的復(fù)溶液復(fù)溶，混合30s；

4）取50µl用于分析。  

    樣本稀釋倍數(shù)：1    檢測下限：0.5ppb

5.3.6 尿樣本處理方法

1）用3ml 0.2M PB緩沖液與1ml經(jīng)離心后的清亮尿樣本混合，混合30s； 

2）取50µl液體用于分析。  

    樣本稀釋倍數(shù): 4    檢測下限：2ppb 

5.3.7 牛奶樣本處理方法

1）取100ul牛奶樣本用0.2M PB緩沖液按1︰19（v/v）稀釋（即100ul牛奶+1.9ml 0.2M PB緩沖液），混合30s；

2）取50µl用于分析。  

    樣本稀釋倍數(shù)：20    檢測下限：10ppb     

5.3.8 飼料樣本處理方法

1）稱取2.0±0.05g飼料樣本至50ml聚苯乙烯離心管中，加入8ml乙腈，振蕩5min，室溫4000r/min以上離心5min；

2）移取1ml上層有機相至10ml潔凈干燥玻璃試管中，在50-60℃氮氣或空氣吹干；

3）加入1ml正己烷，用渦旋儀渦動30s，再加入1ml 0.2M磷酸鹽緩沖溶液，用渦旋儀渦動30s混勻，轉(zhuǎn)入2ml聚苯乙烯離心管中，室溫4000r/min以上離心5min；

4）除去上層有機相，移取100ul下層水相至2ml離心管中，加入 900ul 0.2M磷酸鹽緩沖溶液，用渦旋儀渦動1min，混勻；

5）取50ul用于分析。

   樣本稀釋倍數(shù)：40    檢測下限：20ppb

6 酶聯(lián)免疫試驗步驟

    將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時可能會有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。

實驗開始前，用去離子水將20×濃縮洗滌液按20倍稀釋成工作洗滌液。

6.1 編    號：將樣本和標準品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。

6.2 加樣反應(yīng)：加標準品或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加酶標記物50µl/孔，再加入50µl/孔的抗體工作液，用蓋板膜封板，輕輕振蕩5秒混勻，25℃反應(yīng)45分鐘。

6.3 洗    滌：小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用工作洗滌液250µl/孔充分洗滌5次，每次間隔30秒，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

6.4 顯    色：每孔加入底物液A 50µl，再加底物液B 50µl，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光顯色15分鐘。

6.5 終    止：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，終止反應(yīng)。

6.6 測吸光值：用酶標儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長450/630nm）。測定應(yīng)在終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成。

7 結(jié)果分析

7.1 百分吸光率的計算

    標準液或樣本的百分吸光率等于標準液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以個標準液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即