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YIJI 細胞NADPH*還原酶（NADPH Cytochrome C Reductase）活性 比色法定量檢測試劑盒產品說明書（中文版）
點擊次數：690 發布時間：2013-12-25
YIJI 細胞NADPH細胞色素C還原酶（NADPH Cytochrome C Reductase）活性
比色法定量檢測試劑盒產品說明書（中文版）
主要用途
YIJI細胞NADPH細胞色素C還原酶（NADPH Cytochrome C Reductase）活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過NADPH細胞色素C還原酶反應系統中，細胞色素C還原后峰值的增高，即采用比色法來測定樣品中酶活性的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細胞裂解萃取液樣品（動物、人體）或純化微粒體樣品NADPH細胞色素C還原酶的活性檢測。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定。
技術背景
NADPH細胞色素C還原酶（NADPH Cytochrome C Reductase；EC1.6.2.4），又稱為NADPH細胞色素C還原酶（NADPH-cytochrome P450 reductase；CPR），是一種微粒體（內質網）內電子傳導鏈的黃素蛋白酶，參與藥物、脂肪酸、固醇類、外源性化學分子等羥基化代謝作用，啟動脂質過氧化作用。通過傳遞來自NADPH的電子到細胞色素b5或細胞色素P450家系的酶，包括血紅素氧合酶等，然后鏈接到脂肪酸去飽和酶（desaturase）和延伸酶（elongase）通路上。NADPH細胞色素C還原酶存在于所有組織細胞，肝組織高度表達，受到垂體-甲狀腺軸調控。NADPH細胞色素C還原酶是內質網的標記蛋白，飲食類脂質和生態污染的生物學標記。基于底物氧化型細胞色素C，在輔酶NADPH的存在下，由NADPH細胞色素C還原酶催化作用，產生還原型細胞色素C，由此出現吸光峰值的變化（550nm波長），來定量測定NADPH細胞色素C還原酶的活性。其反應系統為：
產品內容
YIJI清理液（Reagent A） 毫升
YIJI裂解液（Reagent B） 毫升
YIJI緩沖液（Reagent C） 毫升
YIJI反應液（Reagent D） 毫升
YIJI底物液（Reagent E） 毫升
YIJI陰性液（Reagent F） 毫升
產品說明書 1份
保存方式
保存YIJI反應液（Reagent D）和YIJI底物液（Reagent E）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；YIJI底物液（Reagent E）避免光照；有效保證6月
用戶自備
15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器
1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器
細胞刮脫棒：用于脫離貼壁細胞
DOUNCE勻漿器：用于裂解細胞
微型臺式離心機：用于樣品操作
超速離心機：用于樣品操作
比色皿：用于反應和比色的容器
分光光度儀：用于比色分析
實驗步驟
一、 樣品準備
1． 準備好75cm2細胞培養瓶或100mm細胞培養皿的待測培養細胞（1至5 X 107細胞）
2． 小心加入xx毫升YIJI清理液（Reagent A），覆蓋生長表面
3． 小心抽去清理液
4． 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：可以使用*消化）
5． 加入xx毫升YIJI清理液（Reagent A），混勻細胞
6． 移入到預冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）
7． 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
8． 小心抽去上清液
9． 加入xx微升YIJI裂解液（Reagent B）
10． 渦旋震蕩5秒，充分混勻
11． 即刻放入預冷的DOUNCE勻漿器
12． 在冰槽里用勻漿棒勻化細胞（約40下）
13． 將所有細胞勻漿物移入15毫升錐形離心管
14． 放進4℃超速離心機離心30分鐘，速度為9000g
15． 移取上清液到2個新的1.5毫升離心管
16． 放進4℃超速離心機離心60分鐘，速度為100000g
17． 小心抽去上清液
18． 分別加入xx微升YIJI裂解液（Reagent B）
19． 合并到1個1.5毫升離心管
20． 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用GENMED BCA蛋白質濃度定量試劑盒－GMS30031.1）
21． 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作
二、 測定準備
1． 準備好待測樣品（例如細胞裂解萃取液或微粒體樣品等），置于冰槽里
2． 設定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長為550nm，間隔60秒，讀數6次（共5分鐘），并置零
3． YIJI緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度
三、 背景對照測定
1． 移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入xx微升YIJI反應液（Reagent D）
3． 加入xx微升YIJI底物液（Reagent E）
4． 放進30℃培養箱里靜置3分鐘
5． 加入xx微升YIJI陰性液（Reagent F）
6． 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
7． 即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照：550波長讀數5分鐘－550波長讀數0分鐘
四、 樣品活性測定
1． 移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入xx微升YIJI反應液（Reagent D）
3． 加入xx微升YIJI底物液（Reagent E）
4． 放進30℃培養箱里靜置3分鐘
5． 加入50微升待測樣品（注意：100微克微粒體蛋白；樣品須溶解；參見注意事項10）
6． 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）
7． 即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品活性讀數：550波長讀數5分鐘－550波長讀數0分鐘
五、計算樣品活性
注意事項
1． 本產品為20次操作，包括背景對照
2． 操作時，須戴手套
3． 系統操作過程中，背景測定只需1次
4． 樣品須澄清，至關重要
5． 加入樣品啟動反應后3秒內即刻比色測定
6． 分光光度計波長嚴格設置在550nm，誤差10nm將不產生信號
7． 測定值由低到高變化；測定可以持續5分鐘
8． 測定值由低到高變化，即5分鐘測定讀數高于0分鐘測定讀數，表明有酶活性
9． 比色測定后，比色皿須清洗*
10． 建議待測樣本為微粒體，其蛋白濃度為100微克/50微升；待測樣本為細胞裂解懸液，其總蛋白濃度為250至500微克/50微升（本公司提供 YIJI BCA蛋白質濃度定量試劑盒GMS30031.1）
11． 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度
12． NADPH細胞色素C還原酶單位活性定義為：在30℃，pH 7.8條件下，每分鐘內能夠還原1微摩爾細胞色素C所需的酶量作為一個活性單位
13． 本公司提供系列NADPH細胞色素C還原酶檢測試劑產品
質量標準
1． 本產品經鑒定性能穩定
2． 本產品經鑒定檢測敏感
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