反相:吸附劑(固定相)是非極性或弱極性的，如硅膠鍵合C18,C8,C4，C2,-苯基等。流動相為極性(水溶液)或中等極性樣品基質。
吸附劑的極性小于洗脫液的極性。
應用:可以從強極性的溶劑中(如水樣)萃取是非極性或弱極性的化合物。
作用機理:非極性-非極性相互作用，如范德華力或色散力。
 
反相作用機理:
反相萃取分離主要是利用固相萃取材料官能團上的碳氫鍵與目標化合物的碳氫鍵之間的非極性作用力。通常，非極性的反相SPE柱較為適用于從極性基質中萃取分離非極性及中等極性的目標化合物。
 
對于通過非極性作用力吸附在非極性SPE柱上的目標化合物，可以用具有非極性性質的溶劑洗脫，如氯仿、環己烷、乙酸乙酯等。只要溶劑的洗脫強度足以破壞目標化合物與吸附劑非極性官能團之間的范德華力，就可以順利地將目標化合物從SPE柱上洗脫下來。即便是極性較強的甲醇，對于許多化合物來說也具有足夠的非極性作用力將其洗脫。有時單一溶劑不能把疏水性強的目標化合物*洗脫下來，則可考慮使用二氯甲烷：乙酸乙酯（1：1，體積比）。
 
反相固相萃取模式下，溶劑體系的極性應按照樣品溶劑、淋洗溶劑、洗脫溶劑的順序逐漸降低，而它們的洗脫強度逐漸增大。必須保證選擇的樣品溶劑不能將目標化合物洗脫，選擇的淋洗液應在不洗脫目標化合物的前提下限度地洗脫干擾物，所選洗脫液應能恰好*洗脫目標化合物。