操作步驟

用Tide Quencher 染料標記氨基修飾的寡核苷酸

以下方案已經(jīng)過優(yōu)化，可用于標記200μg（~6 A260 nm單位）的專有寡核苷酸。您需要修改協(xié)議，以通過多次實驗為您的特定應用程序獲得佳結果。您的氨基改性OLIGO必須進行處理以去除快速反應并消耗染料SUCCINIMIDYL酯的氨。

1.制備Oligo溶液（溶液A）將氨基修飾的oligo（~200μg）溶解在四硼酸鹽緩沖液（100μL，pH 8.5±0.5）中。

注1：寡核苷酸必須在5'末端用胺基合成。參見Appenxidx 1純化氨基修飾的寡核苷酸。

注2：避免使用含有伯胺的緩沖液，如Tris，因為它們與胺反應性化合物競爭結合。

2.準備染料溶液（溶液B）

2.1通過上下吸移將1mg染料SE溶解在100μLDMSO中（如果可能，> 10mg / mL）。將小瓶側面的溶液原液離心至小瓶底部。

注意：在開始綴合之前準備DMSO染料溶液。染料溶液的長期儲存可降低染料活性。任何含有染料的溶液都應避光。我們不建議您存儲DMSO染料溶液以備將來使用。

3.運行共軛反應

3.1在攪拌或搖動（保持反應混合物避光）的同時向染料溶液（B，20-50μL）中加入寡聚物溶液（A，100μL）。

3.2在室溫下在旋轉器或振蕩器上旋轉或搖動反應混合物4-6小時。

注意：在第一個小時內每10分鐘輕輕渦旋一下小瓶，以確保反應溶液保持充分混合。不要劇烈混合，因為材料可能留在小瓶的兩側。六小時后，應標記50-90％的胺修飾的寡核苷酸分子。如果更方便的話，反應可以孵育過夜。然而，在大多數(shù)情況下，過夜孵育不會導致更高的標記效率。

4.純化染料 - 寡糖結合物

4.1通過乙醇沉淀標記的寡核苷酸進行初步純化

a.將20μL（一般十分之一反應溶液體積）的3M NaCl和300μL冷無水乙醇（通常為兩個半反應溶液體積）加入反應小瓶中。

b.充分混合溶液并將其置于-20℃下30分鐘。

c.將該溶液在微量離心機中以10,000至15,000×g離心30分鐘。

d.注意：如果離心時間不夠長，可能會導致樣品丟失。

f.小心取出上清液，用冷的70％乙醇沖洗沉淀1-3次并短暫干燥。

g.注意：一些未反應的標記試劑可能在反應過程中沉淀或可能粘在反應瓶的壁上。在離心之前，通過大量渦旋混合將該材料全部再溶解。重新溶解標記試劑可確保沉淀的寡核苷酸少被未反應的標記物污染。

4.2通過HPLC或凝膠電泳進行終純化

使用Tide Quencher 染料標記肽

以下方案已經(jīng)過優(yōu)化，用于標記10 mg僅含有一個游離氨基的肽（MW~2000）。您需要修改方案，以便通過多個實驗為您的特定應用程序提供結果。

1.制備肽溶液（溶液A）

1.1將肽（~10 mg）溶解在DMF（~1 ml）中。

注1：肽必須用堿如三乙胺或碳酸鉀中和。

注2：避免使用含有伯胺的緩沖液，如Tris，因為它們與胺反應性化合物競爭結合。

2.準備染料溶液（溶液B）

2.1通過上下吸移將5mg染料SE溶解在500μLDMF中（如果可能，> 10mg / mL）。

2.2注意：在開始綴合之前準備DMF染料溶液。染料溶液的長期儲存可降低染料活性。任何含有染料的溶液都應避光。我們不建議您存儲DMF染料溶液以備將來使用。

3.運行共軛反應

3.1向染料溶液（B，500μL）中加入肽溶液（A，1mL），攪拌或搖動（保持反應混合物不發(fā)光）。

3.2在室溫下攪拌反應混合物4-6小時。

4.純化染料 - 肽綴合物

4.1濃縮反應溶液并在C18柱上純化，得到所需的綴合物。通過HPLC分析級分，合并> 97％純度的級分并凍干。

4.2注1：HPLC純化條件：TEAB緩沖液（三乙基碳酸氫銨，0.25mmol，pH = 7.0-8.0）用作緩沖液A，乙腈用作緩沖液B. HPLC在60分鐘內從0％B至30％B進行（流速：100毫升/分鐘）。

4.3注2：操作過程中避免強光。