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Amplite 熒光法通用型蛋白激酶檢測(cè)試劑盒是美國(guó)AAT Bioquest生產(chǎn)的用于檢測(cè)蛋白激酶的試劑盒，大多數(shù)的商品化蛋白激酶檢測(cè)試劑盒不是基于對(duì)形成的磷酸肽進(jìn)行檢測(cè)，就是對(duì)ATP的減少量進(jìn)行檢測(cè)。使用基于對(duì)磷酸肽進(jìn)行檢測(cè)的激酶檢測(cè)試劑盒，需要花大量的時(shí)間和精力去選擇一種多肽底物；而運(yùn)用基于對(duì)ATP減少量的檢測(cè)法則容易受到許多干擾，因?yàn)闊晒馑孛溉菀资芏喾N生物化合物的抑制或激活。Amplite 通用激酶檢測(cè)試劑盒檢測(cè)機(jī)制是基于對(duì)形成的ADP進(jìn)行檢測(cè)，它與磷酸轉(zhuǎn)移酶的活性成直接的比例關(guān)系，并且可以通過熒光法檢測(cè)。本試劑盒提供了一種快速、簡(jiǎn)單、均一的激酶活性檢測(cè)法。它具有高靈敏度(<0·2 uM ADP)、寬ATP耐受性(1-300 uM)，不基于抗體，無發(fā)射性和不需洗脫就可以對(duì)酶催化產(chǎn)生的總ADP進(jìn)行檢測(cè)，這些特性使它成為檢測(cè)激酶米氏方程動(dòng)力學(xué)，篩選和鑒定激酶抑制劑的一種理想試劑盒。本檢測(cè)法可以便捷地用于96或384微孔板分析，并且無需任何分步操作就可以輕易地實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。百螢生物是AAT Bioquest的中國(guó)代理商，為您提供優(yōu)質(zhì)的Amplite 熒光法通用型蛋白激酶檢測(cè)試劑盒。

實(shí)驗(yàn)方案

樣品實(shí)驗(yàn)方案

簡(jiǎn)要概述

運(yùn)行激酶反應(yīng)（20μL）
添加ADP傳感器緩沖液（20μL）
添加ADP傳感器工作溶液（10μL）
在室溫下孵育15分鐘--1小時(shí)
監(jiān)測(cè)Ex / Em = 540/590 nm處的熒光強(qiáng)度（截止= 570nm）

溶液配制

1.儲(chǔ)備溶液配制

除非另有說明，否則所有未使用的儲(chǔ)備溶液應(yīng)分成一次性等分試樣，并在制備后儲(chǔ)存在-20°C。避免反復(fù)凍融循環(huán)。
1. 1ADP Sensor I儲(chǔ)備溶液（50X）：
將50μLDMSO（組分B3）加入到ADP傳感器1（組分B1）的小瓶中，制備50X ADP傳感器I儲(chǔ)備溶液。

1.2ADP標(biāo)準(zhǔn)溶液（300 mM）：
向ADP標(biāo)準(zhǔn)品（組分C）中加入100μLDdH2O，制成300mM ADP標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

ADP標(biāo)準(zhǔn)配制
取300 mM ADP標(biāo)準(zhǔn)溶液，在激酶反應(yīng)緩沖液中稀釋10,000倍，制成30μMADP標(biāo)準(zhǔn)溶液。取30μMADP標(biāo)準(zhǔn)溶液，在激酶反應(yīng)緩沖液中進(jìn)行1：3連續(xù)稀釋，得到ADP標(biāo)準(zhǔn)溶液的連續(xù)稀釋液。注意：通過包含不含ADP的樣品來測(cè)量背景熒光，在激酶反應(yīng)緩沖液中連續(xù)稀釋ADP標(biāo)準(zhǔn)品。

3.工作溶液配制

將50μL50XADP Sensor I儲(chǔ)備溶液加入到ADP Sensor II（組件B2）的樣品瓶中，制成ADP Sensor工作溶液。注意：重組的ADP不穩(wěn)定，可根據(jù)需要制作新鮮溶液，隨用隨配。

操作步驟

1.運(yùn)行激酶反應(yīng)（此步驟不提供試劑）：

1.1根據(jù)需要制備20μL（或?qū)τ?84孔板10μL）激酶反應(yīng)溶液/孔。應(yīng)根據(jù)需要優(yōu)化激酶反應(yīng)的組分（例如，特定激酶反應(yīng)可能需要優(yōu)化的緩沖系統(tǒng)）。在大多數(shù)情況下，如果您沒有優(yōu)化的激酶緩沖液，ADP檢測(cè)緩沖液（組分D）也可用于運(yùn)行激酶反應(yīng)。

1.2Amplite 熒光激酶檢測(cè)試劑盒用于確定ADP的形成。

2.運(yùn)行Amplite ADP分析：

2.1將20μLADP緩沖液（組分A）和10μLADP工作溶液加入每個(gè)充滿20μL激酶反應(yīng)溶液的孔中，使總ADP測(cè)定體積為50μL/孔。對(duì)于384孔板，在每個(gè)充滿10μL激酶反應(yīng)溶液的孔中加入10μLADP傳感器緩沖液（組分A）和5μLADP，使總ADP測(cè)定體積為25μL/孔。

2.2將反應(yīng)混合物在室溫下孵育15分鐘至1小時(shí)。

2.3用Ex / Em = 540 / 590nm（截止值= 570nm）的熒光板讀數(shù)器監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度。

3.生成ADP校準(zhǔn)曲線（篩選激酶抑制劑不需要）：

3.1添加20μL（對(duì)于96孔板）或10μL（對(duì)于384孔板）/孔ADP傳感器緩沖液（組分A）和10μL（對(duì)于96孔板）或5μL（對(duì)于384）（間隔板）ADP傳感器進(jìn)入連續(xù)稀釋的ADP標(biāo)準(zhǔn)品的每個(gè)孔中，使每個(gè)反應(yīng)的總體積為50μL（對(duì)于96孔板）或25μL（對(duì)于384孔板）。

3.2將反應(yīng)混合物在室溫下孵育15分鐘至1小時(shí)。

3.3用Ex / Em = 540 / 590nm（截止值= 570nm）的熒光板讀數(shù)器監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度。

3.4生成ADP標(biāo)準(zhǔn)曲線。