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Amplite NAD/NADH比率檢測試劑盒(熒光法)

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產品型號15263

品       牌其他品牌

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所  在  地西安市

更新時間:2024-01-30 07:27:06瀏覽次數:231次

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Amplite NAD/NADH比率檢測試劑盒(熒光法) 紅色熒光是美國AAT Bioquest研發的檢測NAD/NADH的試劑盒,煙*胺腺嘌呤二核苷酸(NAD +)和煙*胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP +)是細胞中發現的兩種重要的輔因子。

Amplite NAD/NADH比率檢測試劑盒(熒光法)紅色熒光是美國AAT Bioquest研發的檢測NAD/NADH的試劑盒,煙*胺腺嘌呤二核苷酸(NAD +)和煙*胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP +)是細胞中發現的兩種重要的輔因子。 NADH是NAD +的還原形式,NAD +是NADH的氧化形式。 NAD形成NADP,通過酯鍵將磷酸基團添加到腺苷核苷酸的2'位置。 NADP用于合成代謝生物反應,例如脂肪酸和核酸合成,其需要NADPH作為還原劑。 在葉綠體中,NADP是在光合作用的初步反應中重要的氧化劑。 通過光合作用產生的NADPH用作卡爾文光合作用循環中生物合成反應的還原能力。 傳統的NAD / NADH和NADP / NADPH測定通過監測340nm處NADH或NADPH吸收的變化來完成。 該方法具有低靈敏度和高干擾,因為該測定在需要昂貴的石英微孔板的UV范圍內進行。

這種Amplite 熒光NAD / NADH比率分析試劑盒為敏感檢測NAD,NADH及其比例提供了一種便捷的方法。 系統中的酶特異性識別酶循環反應中的NAD / NADH,其顯著提高了檢測靈敏度。 此外,該測定具有非常低的背景,因為其在紅色可見范圍內運行,這顯著降低了來自生物樣品的干擾。 無需從樣品混合物中純化NAD / NADH。 可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式進行測定。 其信號可以通過熒光酶標儀在Ex / Em = 530-570 / 590-600nm(大Ex / Em = 540/590nm)或吸光度酶標儀在~576nm處容易地讀取。 該試劑盒提供NAD和NADH提取緩沖液,以及細胞裂解緩沖液,方便您使用。 它經常用于從細胞裂解物中測定NAD / NADH。百螢生物是AAT Bioquest的中國代理商,為您提供優質的Amplite NAD/NADH比率檢測試劑盒(熒光法)

實驗方案

96孔板測定示例

概述

準備25μLNADH標準品和/或測試樣品

添加25μLNADH或NAD提取溶液

在室溫下孵育15分鐘

加入25μLNAD或NADH萃取溶液

加入75μLNAD/ NADH反應混合物

在室溫下孵育15分鐘至2小時

監測Ex / Em = 540 / 590nm處的熒光強度

注意:在開始實驗之前,在室溫下解凍每個試劑盒組分中的一個。

操作方法

1.準備NADH儲備溶液:

將200μLPBS緩沖液加入到NADH標準品(組分C)的小瓶中,得到1mM(1nmol / L)NADH儲備溶液。

注意:未使用的NADH儲備溶液應分成單次使用的等分試樣并儲存在-20℃。

2.準備NAD / NADH反應混合物:

將10mL NADH傳感器緩沖液(組分B)加入NAD / NADH再循環酶混合物(組分A)的瓶中,并充分混合。

注意:這種NAD / NADH反應混合物足以用于兩個96孔板。 未使用的NAD / NADH反應混合物應分成一次性等分試樣并儲存在-20℃。

3.準備連續稀釋的NADH標準品(0至10μM):

3.1將30μL1mMNADH儲備溶液(來自步驟1)加入970μLPBS緩沖液(pH7.4)中,得到30μM(30pmol / L)NADH標準溶液。

注意:稀釋的NADH標準溶液不穩定,應在4小時內使用。

3.2取200μL30M NADH標準溶液(來自步驟3.1)進行1:3連續稀釋,得到10,3,1,0.3,0.1,0.03和0 M系列稀釋的NADH標準品。

3.3如表1和2中所述,將連續稀釋的NADH標準品和/或含NAD / NADH的測試樣品添加到固體黑色96孔微量培養板中。

注意:根據需要準備細胞或組織樣本。


表1.實心黑色96孔微孔板中NADH標準品和測試樣品的布局

BL

BL

TS

TS

TS (NADH)

TS (NADH)

TS (NAD)

TS (NAD)

NS1

NS1

….

….

….

….

….

….

NS2

NS2







NS3

NS3







NS4

NS4







NS5

NS5







NS6

NS6







NS7

NS7







注意:NS = NAD / NADH標準; BL =空白對照; TS =測試樣品; TS(NADH)=用NADH萃取溶液處理10至15分鐘的測試樣品,然后用NAD萃取溶液中和; TS(NAD)=用NAD提取溶液處理10至15分鐘的測試樣品,然后用NADH提取溶液中和。


表2每個孔的試劑組成

NADH Standard

Blank Control

Test Sample (NAD/NADH)

Test Sample

(NADH Extract)

Test Sample

(NAD Extract)

Serial Dilutions*: 25 μL

PBS: 25 μL

Test Sample: 25 μL

Test Sample: 25 μL

Test Sample: 25 μL

Component F:

25 μL

Component F: 25 μL

Component F: 25 μL

Component D: 25 μL

Component E: 25 μL

Incubate at room temperature for 10 to 15 minutes

Component F: 25 μL

Component F: 25 μL

Component F: 25 μL

Component E: 25 μL

Component D: 25 μL

Total: 75 μL

Total: 75 μL

Total: 75 μL

Total: 75 μL

Total: 75 μL

*注意:將連續稀釋的NADH標準品從0.03μM至30μM加入NS1至NS7的孔中,一式兩份。 高濃度的NADH(例如,>300μM,終濃度)可能由于NADH傳感器(非熒光產物)的過度氧化而導致熒光信號降低。


3.4對于NADH提取(NADH):將25μLNADH提取溶液(組分D)加入含有NAD / NADH的測試樣品的孔中。 在室溫下孵育10至15分鐘,然后加入25μLNAD提取溶液(組分E)以中和NADH提取物,如表1和2中所述。

對于NAD提取(NAD):將25μLNAD提取溶液(組分E)加入含有NAD / NADH的測試樣品的孔中。 在室溫下孵育10至15分鐘,然后加入25μLNADH提取溶液(組分D)以中和NAD提取物,如表1和2中所述。

對于總NAD和NADH:將25μLNAD/ NADH對照溶液(組分F)加入NADH標準品和含有NAD / NADH的測試樣品的孔中。 在室溫下孵育10至15分鐘,然后如表1和2中所述添加25μL對照溶液(組分F)。

注意1:根據需要準備細胞或組織樣本。 NAD / NADH裂解緩沖液(組分G)可用于裂解細胞(詳見附錄)。

注意2:在健康的哺乳動物細胞中,與NADH相比,NAD更多,因此可以簡單地使用總NAD和NADH減去NAD來計算NADH的量。

4.在上清液反應中運行NAD / NADH測定:

4.1將75μLNADH反應混合物(來自步驟2)加入NADH標準品,空白對照和測試樣品(來自步驟3.4)的每個孔中,使得總NADH測定體積為150μL/孔。

4.2在室溫下孵育反應15分鐘至2小時,避光。

4.3用Ex / Em = 540 / 590nm(截止值570nm)的熒光板讀數器監測熒光增加。

注意:也可以將板的內容物轉移到白色透明底板上,并用吸光度酶標儀在576±5nm的波長下讀數。 與熒光讀數相比,吸收檢測具有較低的靈敏度。



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