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當(dāng)前位置:西安百螢生物科技有限公司>>trFluor™ 染料和試劑盒>>比率檢測(cè)試劑盒>> 15263Amplite NAD/NADH比率檢測(cè)試劑盒(熒光法)
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產(chǎn)品型號(hào)15263
品 牌其他品牌
廠商性質(zhì)代理商
所 在 地西安市
更新時(shí)間:2024-01-30 07:27:06瀏覽次數(shù):230次
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Amplite™熒光法NADP/NADPH比率檢測(cè)試劑盒
Amplite™熒光法NAD/NADH比率檢測(cè)試劑盒
Amplite NAD/NADH比率檢測(cè)試劑盒(比色法)
Amplite NAD/NADH比率檢測(cè)試劑盒(熒光法)紅色熒光是美國AAT Bioquest研發(fā)的檢測(cè)NAD/NADH的試劑盒,煙*胺腺嘌呤二核苷酸(NAD +)和煙*胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP +)是細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的兩種重要的輔因子。 NADH是NAD +的還原形式,NAD +是NADH的氧化形式。 NAD形成NADP,通過酯鍵將磷酸基團(tuán)添加到腺苷核苷酸的2'位置。 NADP用于合成代謝生物反應(yīng),例如脂肪酸和核酸合成,其需要NADPH作為還原劑。 在葉綠體中,NADP是在光合作用的初步反應(yīng)中重要的氧化劑。 通過光合作用產(chǎn)生的NADPH用作卡爾文光合作用循環(huán)中生物合成反應(yīng)的還原能力。 傳統(tǒng)的NAD / NADH和NADP / NADPH測(cè)定通過監(jiān)測(cè)340nm處NADH或NADPH吸收的變化來完成。 該方法具有低靈敏度和高干擾,因?yàn)樵摐y(cè)定在需要昂貴的石英微孔板的UV范圍內(nèi)進(jìn)行。
這種Amplite 熒光NAD / NADH比率分析試劑盒為敏感檢測(cè)NAD,NADH及其比例提供了一種便捷的方法。 系統(tǒng)中的酶特異性識(shí)別酶循環(huán)反應(yīng)中的NAD / NADH,其顯著提高了檢測(cè)靈敏度。 此外,該測(cè)定具有非常低的背景,因?yàn)槠湓诩t色可見范圍內(nèi)運(yùn)行,這顯著降低了來自生物樣品的干擾。 無需從樣品混合物中純化NAD / NADH。 可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式進(jìn)行測(cè)定。 其信號(hào)可以通過熒光酶標(biāo)儀在Ex / Em = 530-570 / 590-600nm(大Ex / Em = 540/590nm)或吸光度酶標(biāo)儀在~576nm處容易地讀取。 該試劑盒提供NAD和NADH提取緩沖液,以及細(xì)胞裂解緩沖液,方便您使用。 它經(jīng)常用于從細(xì)胞裂解物中測(cè)定NAD / NADH。百螢生物是AAT Bioquest的中國代理商,為您提供優(yōu)質(zhì)的Amplite NAD/NADH比率檢測(cè)試劑盒(熒光法)。
實(shí)驗(yàn)方案
96孔板測(cè)定示例
概述
準(zhǔn)備25μLNADH標(biāo)準(zhǔn)品和/或測(cè)試樣品
添加25μLNADH或NAD提取溶液
在室溫下孵育15分鐘
加入25μLNAD或NADH萃取溶液
加入75μLNAD/ NADH反應(yīng)混合物
在室溫下孵育15分鐘至2小時(shí)
監(jiān)測(cè)Ex / Em = 540 / 590nm處的熒光強(qiáng)度
注意:在開始實(shí)驗(yàn)之前,在室溫下解凍每個(gè)試劑盒組分中的一個(gè)。
操作方法
1.準(zhǔn)備NADH儲(chǔ)備溶液:
將200μLPBS緩沖液加入到NADH標(biāo)準(zhǔn)品(組分C)的小瓶中,得到1mM(1nmol / L)NADH儲(chǔ)備溶液。
注意:未使用的NADH儲(chǔ)備溶液應(yīng)分成單次使用的等分試樣并儲(chǔ)存在-20℃。
2.準(zhǔn)備NAD / NADH反應(yīng)混合物:
將10mL NADH傳感器緩沖液(組分B)加入NAD / NADH再循環(huán)酶混合物(組分A)的瓶中,并充分混合。
注意:這種NAD / NADH反應(yīng)混合物足以用于兩個(gè)96孔板。 未使用的NAD / NADH反應(yīng)混合物應(yīng)分成一次性等分試樣并儲(chǔ)存在-20℃。
3.準(zhǔn)備連續(xù)稀釋的NADH標(biāo)準(zhǔn)品(0至10μM):
3.1將30μL1mMNADH儲(chǔ)備溶液(來自步驟1)加入970μLPBS緩沖液(pH7.4)中,得到30μM(30pmol / L)NADH標(biāo)準(zhǔn)溶液。
注意:稀釋的NADH標(biāo)準(zhǔn)溶液不穩(wěn)定,應(yīng)在4小時(shí)內(nèi)使用。
3.2取200μL30M NADH標(biāo)準(zhǔn)溶液(來自步驟3.1)進(jìn)行1:3連續(xù)稀釋,得到10,3,1,0.3,0.1,0.03和0 M系列稀釋的NADH標(biāo)準(zhǔn)品。
3.3如表1和2中所述,將連續(xù)稀釋的NADH標(biāo)準(zhǔn)品和/或含NAD / NADH的測(cè)試樣品添加到固體黑色96孔微量培養(yǎng)板中。
注意:根據(jù)需要準(zhǔn)備細(xì)胞或組織樣本。
表1.實(shí)心黑色96孔微孔板中NADH標(biāo)準(zhǔn)品和測(cè)試樣品的布局
BL | BL | TS | TS | TS (NADH) | TS (NADH) | TS (NAD) | TS (NAD) |
NS1 | NS1 | …. | …. | …. | …. | …. | …. |
NS2 | NS2 | ||||||
NS3 | NS3 | ||||||
NS4 | NS4 | ||||||
NS5 | NS5 | ||||||
NS6 | NS6 | ||||||
NS7 | NS7 |
注意:NS = NAD / NADH標(biāo)準(zhǔn); BL =空白對(duì)照; TS =測(cè)試樣品; TS(NADH)=用NADH萃取溶液處理10至15分鐘的測(cè)試樣品,然后用NAD萃取溶液中和; TS(NAD)=用NAD提取溶液處理10至15分鐘的測(cè)試樣品,然后用NADH提取溶液中和。
表2每個(gè)孔的試劑組成
NADH Standard | Blank Control | Test Sample (NAD/NADH) | Test Sample (NADH Extract) | Test Sample (NAD Extract) |
Serial Dilutions*: 25 μL | PBS: 25 μL | Test Sample: 25 μL | Test Sample: 25 μL | Test Sample: 25 μL |
Component F: 25 μL | Component F: 25 μL | Component F: 25 μL | Component D: 25 μL | Component E: 25 μL |
Incubate at room temperature for 10 to 15 minutes | ||||
Component F: 25 μL | Component F: 25 μL | Component F: 25 μL | Component E: 25 μL | Component D: 25 μL |
Total: 75 μL | Total: 75 μL | Total: 75 μL | Total: 75 μL | Total: 75 μL |
*注意:將連續(xù)稀釋的NADH標(biāo)準(zhǔn)品從0.03μM至30μM加入NS1至NS7的孔中,一式兩份。 高濃度的NADH(例如,>300μM,終濃度)可能由于NADH傳感器(非熒光產(chǎn)物)的過度氧化而導(dǎo)致熒光信號(hào)降低。
3.4對(duì)于NADH提取(NADH):將25μLNADH提取溶液(組分D)加入含有NAD / NADH的測(cè)試樣品的孔中。 在室溫下孵育10至15分鐘,然后加入25μLNAD提取溶液(組分E)以中和NADH提取物,如表1和2中所述。
對(duì)于NAD提取(NAD):將25μLNAD提取溶液(組分E)加入含有NAD / NADH的測(cè)試樣品的孔中。 在室溫下孵育10至15分鐘,然后加入25μLNADH提取溶液(組分D)以中和NAD提取物,如表1和2中所述。
對(duì)于總NAD和NADH:將25μLNAD/ NADH對(duì)照溶液(組分F)加入NADH標(biāo)準(zhǔn)品和含有NAD / NADH的測(cè)試樣品的孔中。 在室溫下孵育10至15分鐘,然后如表1和2中所述添加25μL對(duì)照溶液(組分F)。
注意1:根據(jù)需要準(zhǔn)備細(xì)胞或組織樣本。 NAD / NADH裂解緩沖液(組分G)可用于裂解細(xì)胞(詳見附錄)。
注意2:在健康的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中,與NADH相比,NAD更多,因此可以簡(jiǎn)單地使用總NAD和NADH減去NAD來計(jì)算NADH的量。
4.在上清液反應(yīng)中運(yùn)行NAD / NADH測(cè)定:
4.1將75μLNADH反應(yīng)混合物(來自步驟2)加入NADH標(biāo)準(zhǔn)品,空白對(duì)照和測(cè)試樣品(來自步驟3.4)的每個(gè)孔中,使得總NADH測(cè)定體積為150μL/孔。
4.2在室溫下孵育反應(yīng)15分鐘至2小時(shí),避光。
4.3用Ex / Em = 540 / 590nm(截止值570nm)的熒光板讀數(shù)器監(jiān)測(cè)熒光增加。
注意:也可以將板的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到白色透明底板上,并用吸光度酶標(biāo)儀在576±5nm的波長下讀數(shù)。 與熒光讀數(shù)相比,吸收檢測(cè)具有較低的靈敏度。
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