Amplite NAD/NADH比率檢測(cè)試劑盒（熒光法）紅色熒光是美國(guó)AAT Bioquest研發(fā)的檢測(cè)NAD/NADH的試劑盒，煙*胺腺嘌呤二核苷酸（NAD +）和煙*胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP +）是細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的兩種重要的輔因子。 NADH是NAD +的還原形式，NAD +是NADH的氧化形式。 NAD形成NADP，通過(guò)酯鍵將磷酸基團(tuán)添加到腺苷核苷酸的2'位置。 NADP用于合成代謝生物反應(yīng)，例如脂肪酸和核酸合成，其需要NADPH作為還原劑。 在葉綠體中，NADP是在光合作用的初步反應(yīng)中重要的氧化劑。 通過(guò)光合作用產(chǎn)生的NADPH用作卡爾文光合作用循環(huán)中生物合成反應(yīng)的還原能力。 傳統(tǒng)的NAD / NADH和NADP / NADPH測(cè)定通過(guò)監(jiān)測(cè)340nm處NADH或NADPH吸收的變化來(lái)完成。 該方法具有低靈敏度和高干擾，因?yàn)樵摐y(cè)定在需要昂貴的石英微孔板的UV范圍內(nèi)進(jìn)行。

這種Amplite 熒光NAD / NADH比率分析試劑盒為敏感檢測(cè)NAD，NADH及其比例提供了一種便捷的方法。 系統(tǒng)中的酶特異性識(shí)別酶循環(huán)反應(yīng)中的NAD / NADH，其顯著提高了檢測(cè)靈敏度。 此外，該測(cè)定具有非常低的背景，因?yàn)槠湓诩t色可見(jiàn)范圍內(nèi)運(yùn)行，這顯著降低了來(lái)自生物樣品的干擾。 無(wú)需從樣品混合物中純化NAD / NADH。 可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式進(jìn)行測(cè)定。 其信號(hào)可以通過(guò)熒光酶標(biāo)儀在Ex / Em = 530-570 / 590-600nm（大Ex / Em = 540/590nm）或吸光度酶標(biāo)儀在~576nm處容易地讀取。 該試劑盒提供NAD和NADH提取緩沖液，以及細(xì)胞裂解緩沖液，方便您使用。 它經(jīng)常用于從細(xì)胞裂解物中測(cè)定NAD / NADH。百螢生物是AAT Bioquest的中國(guó)代理商，為您提供優(yōu)質(zhì)的Amplite NAD/NADH比率檢測(cè)試劑盒（熒光法）。

實(shí)驗(yàn)方案

96孔板測(cè)定示例

概述

準(zhǔn)備25μLNADH標(biāo)準(zhǔn)品和/或測(cè)試樣品

添加25μLNADH或NAD提取溶液

在室溫下孵育15分鐘

加入25μLNAD或NADH萃取溶液

加入75μLNAD/ NADH反應(yīng)混合物

在室溫下孵育15分鐘至2小時(shí)

監(jiān)測(cè)Ex / Em = 540 / 590nm處的熒光強(qiáng)度

注意：在開(kāi)始實(shí)驗(yàn)之前，在室溫下解凍每個(gè)試劑盒組分中的一個(gè)。

操作方法

1.準(zhǔn)備NADH儲(chǔ)備溶液：

將200μLPBS緩沖液加入到NADH標(biāo)準(zhǔn)品（組分C）的小瓶中，得到1mM（1nmol / L）NADH儲(chǔ)備溶液。

注意：未使用的NADH儲(chǔ)備溶液應(yīng)分成單次使用的等分試樣并儲(chǔ)存在-20℃。

2.準(zhǔn)備NAD / NADH反應(yīng)混合物：

將10mL NADH傳感器緩沖液（組分B）加入NAD / NADH再循環(huán)酶混合物（組分A）的瓶中，并充分混合。

注意：這種NAD / NADH反應(yīng)混合物足以用于兩個(gè)96孔板。 未使用的NAD / NADH反應(yīng)混合物應(yīng)分成一次性等分試樣并儲(chǔ)存在-20℃。

3.準(zhǔn)備連續(xù)稀釋的NADH標(biāo)準(zhǔn)品（0至10μM）：

3.1將30μL1mMNADH儲(chǔ)備溶液（來(lái)自步驟1）加入970μLPBS緩沖液（pH7.4）中，得到30μM（30pmol / L）NADH標(biāo)準(zhǔn)溶液。

注意：稀釋的NADH標(biāo)準(zhǔn)溶液不穩(wěn)定，應(yīng)在4小時(shí)內(nèi)使用。

3.2取200μL30M NADH標(biāo)準(zhǔn)溶液（來(lái)自步驟3.1）進(jìn)行1：3連續(xù)稀釋，得到10,3,1,0.3,0.1,0.03和0 M系列稀釋的NADH標(biāo)準(zhǔn)品。

3.3如表1和2中所述，將連續(xù)稀釋的NADH標(biāo)準(zhǔn)品和/或含NAD / NADH的測(cè)試樣品添加到固體黑色96孔微量培養(yǎng)板中。

注意：根據(jù)需要準(zhǔn)備細(xì)胞或組織樣本。

表1.實(shí)心黑色96孔微孔板中NADH標(biāo)準(zhǔn)品和測(cè)試樣品的布局

注意：NS = NAD / NADH標(biāo)準(zhǔn); BL =空白對(duì)照; TS =測(cè)試樣品; TS（NADH）=用NADH萃取溶液處理10至15分鐘的測(cè)試樣品，然后用NAD萃取溶液中和; TS（NAD）=用NAD提取溶液處理10至15分鐘的測(cè)試樣品，然后用NADH提取溶液中和。

表2每個(gè)孔的試劑組成

*注意：將連續(xù)稀釋的NADH標(biāo)準(zhǔn)品從0.03μM至30μM加入NS1至NS7的孔中，一式兩份。 高濃度的NADH（例如，>300μM，終濃度）可能由于NADH傳感器（非熒光產(chǎn)物）的過(guò)度氧化而導(dǎo)致熒光信號(hào)降低。

3.4對(duì)于NADH提取（NADH）：將25μLNADH提取溶液（組分D）加入含有NAD / NADH的測(cè)試樣品的孔中。 在室溫下孵育10至15分鐘，然后加入25μLNAD提取溶液（組分E）以中和NADH提取物，如表1和2中所述。

對(duì)于NAD提取（NAD）：將25μLNAD提取溶液（組分E）加入含有NAD / NADH的測(cè)試樣品的孔中。 在室溫下孵育10至15分鐘，然后加入25μLNADH提取溶液（組分D）以中和NAD提取物，如表1和2中所述。

對(duì)于總NAD和NADH：將25μLNAD/ NADH對(duì)照溶液（組分F）加入NADH標(biāo)準(zhǔn)品和含有NAD / NADH的測(cè)試樣品的孔中。 在室溫下孵育10至15分鐘，然后如表1和2中所述添加25μL對(duì)照溶液（組分F）。

注意1：根據(jù)需要準(zhǔn)備細(xì)胞或組織樣本。 NAD / NADH裂解緩沖液（組分G）可用于裂解細(xì)胞（詳見(jiàn)附錄）。

注意2：在健康的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，與NADH相比，NAD更多，因此可以簡(jiǎn)單地使用總NAD和NADH減去NAD來(lái)計(jì)算NADH的量。

4.在上清液反應(yīng)中運(yùn)行NAD / NADH測(cè)定：

4.1將75μLNADH反應(yīng)混合物（來(lái)自步驟2）加入NADH標(biāo)準(zhǔn)品，空白對(duì)照和測(cè)試樣品（來(lái)自步驟3.4）的每個(gè)孔中，使得總NADH測(cè)定體積為150μL/孔。

4.2在室溫下孵育反應(yīng)15分鐘至2小時(shí)，避光。

4.3用Ex / Em = 540 / 590nm（截止值570nm）的熒光板讀數(shù)器監(jiān)測(cè)熒光增加。

注意：也可以將板的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到白色透明底板上，并用吸光度酶標(biāo)儀在576±5nm的波長(zhǎng)下讀數(shù)。 與熒光讀數(shù)相比，吸收檢測(cè)具有較低的靈敏度。