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Amplite NAD/NADH比率檢測(cè)試劑盒(熒光法)

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產(chǎn)品型號(hào)15263

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所  在  地西安市

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張經(jīng)理

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Amplite NAD/NADH比率檢測(cè)試劑盒(熒光法) 紅色熒光是美國AAT Bioquest研發(fā)的檢測(cè)NAD/NADH的試劑盒,煙*胺腺嘌呤二核苷酸(NAD +)和煙*胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP +)是細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的兩種重要的輔因子。

Amplite NAD/NADH比率檢測(cè)試劑盒(熒光法)紅色熒光是美國AAT Bioquest研發(fā)的檢測(cè)NAD/NADH的試劑盒,煙*胺腺嘌呤二核苷酸(NAD +)和煙*胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP +)是細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的兩種重要的輔因子。 NADH是NAD +的還原形式,NAD +是NADH的氧化形式。 NAD形成NADP,通過酯鍵將磷酸基團(tuán)添加到腺苷核苷酸的2'位置。 NADP用于合成代謝生物反應(yīng),例如脂肪酸和核酸合成,其需要NADPH作為還原劑。 在葉綠體中,NADP是在光合作用的初步反應(yīng)中重要的氧化劑。 通過光合作用產(chǎn)生的NADPH用作卡爾文光合作用循環(huán)中生物合成反應(yīng)的還原能力。 傳統(tǒng)的NAD / NADH和NADP / NADPH測(cè)定通過監(jiān)測(cè)340nm處NADH或NADPH吸收的變化來完成。 該方法具有低靈敏度和高干擾,因?yàn)樵摐y(cè)定在需要昂貴的石英微孔板的UV范圍內(nèi)進(jìn)行。

這種Amplite 熒光NAD / NADH比率分析試劑盒為敏感檢測(cè)NAD,NADH及其比例提供了一種便捷的方法。 系統(tǒng)中的酶特異性識(shí)別酶循環(huán)反應(yīng)中的NAD / NADH,其顯著提高了檢測(cè)靈敏度。 此外,該測(cè)定具有非常低的背景,因?yàn)槠湓诩t色可見范圍內(nèi)運(yùn)行,這顯著降低了來自生物樣品的干擾。 無需從樣品混合物中純化NAD / NADH。 可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式進(jìn)行測(cè)定。 其信號(hào)可以通過熒光酶標(biāo)儀在Ex / Em = 530-570 / 590-600nm(大Ex / Em = 540/590nm)或吸光度酶標(biāo)儀在~576nm處容易地讀取。 該試劑盒提供NAD和NADH提取緩沖液,以及細(xì)胞裂解緩沖液,方便您使用。 它經(jīng)常用于從細(xì)胞裂解物中測(cè)定NAD / NADH。百螢生物是AAT Bioquest的中國代理商,為您提供優(yōu)質(zhì)的Amplite NAD/NADH比率檢測(cè)試劑盒(熒光法)

實(shí)驗(yàn)方案

96孔板測(cè)定示例

概述

準(zhǔn)備25μLNADH標(biāo)準(zhǔn)品和/或測(cè)試樣品

添加25μLNADH或NAD提取溶液

在室溫下孵育15分鐘

加入25μLNAD或NADH萃取溶液

加入75μLNAD/ NADH反應(yīng)混合物

在室溫下孵育15分鐘至2小時(shí)

監(jiān)測(cè)Ex / Em = 540 / 590nm處的熒光強(qiáng)度

注意:在開始實(shí)驗(yàn)之前,在室溫下解凍每個(gè)試劑盒組分中的一個(gè)。

操作方法

1.準(zhǔn)備NADH儲(chǔ)備溶液:

將200μLPBS緩沖液加入到NADH標(biāo)準(zhǔn)品(組分C)的小瓶中,得到1mM(1nmol / L)NADH儲(chǔ)備溶液。

注意:未使用的NADH儲(chǔ)備溶液應(yīng)分成單次使用的等分試樣并儲(chǔ)存在-20℃。

2.準(zhǔn)備NAD / NADH反應(yīng)混合物:

將10mL NADH傳感器緩沖液(組分B)加入NAD / NADH再循環(huán)酶混合物(組分A)的瓶中,并充分混合。

注意:這種NAD / NADH反應(yīng)混合物足以用于兩個(gè)96孔板。 未使用的NAD / NADH反應(yīng)混合物應(yīng)分成一次性等分試樣并儲(chǔ)存在-20℃。

3.準(zhǔn)備連續(xù)稀釋的NADH標(biāo)準(zhǔn)品(0至10μM):

3.1將30μL1mMNADH儲(chǔ)備溶液(來自步驟1)加入970μLPBS緩沖液(pH7.4)中,得到30μM(30pmol / L)NADH標(biāo)準(zhǔn)溶液。

注意:稀釋的NADH標(biāo)準(zhǔn)溶液不穩(wěn)定,應(yīng)在4小時(shí)內(nèi)使用。

3.2取200μL30M NADH標(biāo)準(zhǔn)溶液(來自步驟3.1)進(jìn)行1:3連續(xù)稀釋,得到10,3,1,0.3,0.1,0.03和0 M系列稀釋的NADH標(biāo)準(zhǔn)品。

3.3如表1和2中所述,將連續(xù)稀釋的NADH標(biāo)準(zhǔn)品和/或含NAD / NADH的測(cè)試樣品添加到固體黑色96孔微量培養(yǎng)板中。

注意:根據(jù)需要準(zhǔn)備細(xì)胞或組織樣本。


表1.實(shí)心黑色96孔微孔板中NADH標(biāo)準(zhǔn)品和測(cè)試樣品的布局

BL

BL

TS

TS

TS (NADH)

TS (NADH)

TS (NAD)

TS (NAD)

NS1

NS1

….

….

….

….

….

….

NS2

NS2







NS3

NS3







NS4

NS4







NS5

NS5







NS6

NS6







NS7

NS7







注意:NS = NAD / NADH標(biāo)準(zhǔn); BL =空白對(duì)照; TS =測(cè)試樣品; TS(NADH)=用NADH萃取溶液處理10至15分鐘的測(cè)試樣品,然后用NAD萃取溶液中和; TS(NAD)=用NAD提取溶液處理10至15分鐘的測(cè)試樣品,然后用NADH提取溶液中和。


表2每個(gè)孔的試劑組成

NADH Standard

Blank Control

Test Sample (NAD/NADH)

Test Sample

(NADH Extract)

Test Sample

(NAD Extract)

Serial Dilutions*: 25 μL

PBS: 25 μL

Test Sample: 25 μL

Test Sample: 25 μL

Test Sample: 25 μL

Component F:

25 μL

Component F: 25 μL

Component F: 25 μL

Component D: 25 μL

Component E: 25 μL

Incubate at room temperature for 10 to 15 minutes

Component F: 25 μL

Component F: 25 μL

Component F: 25 μL

Component E: 25 μL

Component D: 25 μL

Total: 75 μL

Total: 75 μL

Total: 75 μL

Total: 75 μL

Total: 75 μL

*注意:將連續(xù)稀釋的NADH標(biāo)準(zhǔn)品從0.03μM至30μM加入NS1至NS7的孔中,一式兩份。 高濃度的NADH(例如,>300μM,終濃度)可能由于NADH傳感器(非熒光產(chǎn)物)的過度氧化而導(dǎo)致熒光信號(hào)降低。


3.4對(duì)于NADH提取(NADH):將25μLNADH提取溶液(組分D)加入含有NAD / NADH的測(cè)試樣品的孔中。 在室溫下孵育10至15分鐘,然后加入25μLNAD提取溶液(組分E)以中和NADH提取物,如表1和2中所述。

對(duì)于NAD提取(NAD):將25μLNAD提取溶液(組分E)加入含有NAD / NADH的測(cè)試樣品的孔中。 在室溫下孵育10至15分鐘,然后加入25μLNADH提取溶液(組分D)以中和NAD提取物,如表1和2中所述。

對(duì)于總NAD和NADH:將25μLNAD/ NADH對(duì)照溶液(組分F)加入NADH標(biāo)準(zhǔn)品和含有NAD / NADH的測(cè)試樣品的孔中。 在室溫下孵育10至15分鐘,然后如表1和2中所述添加25μL對(duì)照溶液(組分F)。

注意1:根據(jù)需要準(zhǔn)備細(xì)胞或組織樣本。 NAD / NADH裂解緩沖液(組分G)可用于裂解細(xì)胞(詳見附錄)。

注意2:在健康的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中,與NADH相比,NAD更多,因此可以簡(jiǎn)單地使用總NAD和NADH減去NAD來計(jì)算NADH的量。

4.在上清液反應(yīng)中運(yùn)行NAD / NADH測(cè)定:

4.1將75μLNADH反應(yīng)混合物(來自步驟2)加入NADH標(biāo)準(zhǔn)品,空白對(duì)照和測(cè)試樣品(來自步驟3.4)的每個(gè)孔中,使得總NADH測(cè)定體積為150μL/孔。

4.2在室溫下孵育反應(yīng)15分鐘至2小時(shí),避光。

4.3用Ex / Em = 540 / 590nm(截止值570nm)的熒光板讀數(shù)器監(jiān)測(cè)熒光增加。

注意:也可以將板的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到白色透明底板上,并用吸光度酶標(biāo)儀在576±5nm的波長下讀數(shù)。 與熒光讀數(shù)相比,吸收檢測(cè)具有較低的靈敏度。



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