通過流式細胞術進行 PBMC（外周血單核細胞） 分析可廣泛應用于研究和臨床研究，包括 HIV 研究、癌癥免疫治療和基于細胞因子的免疫反應的基礎研究。PBMCs通常通過密度梯度離心或磁珠分離從外周血、骨髓和臍帶中提取。這些方法旨在將白細胞與紅細胞 (RBC) 等其他細胞成分分離。

流式細胞術的一個常見應用是 PBMC 免疫表型分析。該技術測量被稱為“分化簇"(CD) 標記的細胞表面分子的表達，以識別、區分和表征 PBMC 亞群。除了 CD 標記表達之外，計數和細胞大小的精確監測對于該分析也至關重要。其中一個例子是嵌合抗原受體 T (CAR-T) 細胞癌癥免疫治療領域。

為了表征 PBMC 上的 CD 標記，將針對 CD 標記的抗體與藻紅蛋白 (PE) 等熒光團綴合。然后使用流式細胞儀測量熒光強度，以量化 CD 標記表達水平并區分 PBMC 亞群。本應用說明演示了用于表征 PBMC 上 CD 標記的單熒光團和雙熒光團 PBMC 染色技術。

CD45 抗體和小鼠 IgG 綴合物的制備

材料：

· 1.Buccutite™ 快速 PE 抗體標記試劑盒（貨號 1310）

注意：試劑盒足以進行 2 次標記反應，每個反應 100 µg 抗體

· 2.Buccutite™ 快速 APC 抗體標記試劑盒（貨號 1311）

注意：試劑盒足以進行 2 次標記反應，每個反應 100 µg 抗體

· 3.1X PBS 緩沖液 (pH 7.2 – 7.4)

· 4.4 個 2 mL 洗滌管

· 5.4 個 1.5 mL 收集管

· 6.離心機

所有 CD45 抗體和小鼠 IgG 綴合物均使用以下應用說明制備：

· Buccutite™ 快速藻膽蛋白抗體偶聯

CD45 抗體和小鼠 IgG 綴合物的濃度：

使用 Buccutite™ 快速藻膽蛋白抗體偶聯應用說明和 Buccutite™ 快速抗體標記試劑盒（貨號 1310 和 1311）制備的 CD45 和小鼠 IgG 偶聯物的濃度如下：

PBMC的制備

冷凍保存的PBMC解凍并制備如下：

材料：

1.人類PBMC（冷凍保存，1000萬個細胞/瓶）

2.血細胞培養基

3.胎牛血清

4.15mL錐形管

5. 離心機

6. 吸管

制備方法

1. 收到冷凍的 PBMC 后，立即解凍細胞并開始培養，以保持最高的細胞活力。

2. 要解凍細胞，請將小瓶放入 37°C 水中，輕輕攪拌約 1 分鐘。

a. 注意：將蓋子遠離水以盡量減少污染風險。

3. 將細胞移入含有 10% 胎牛血清的 10 mL 新鮮血細胞培養基的 15 mL 錐形管中。

a. 注意：總體積 = 10.1 mL（100 µL PBMC + 9 mL 新鮮血細胞培養基 + 1 mL 胎牛血清）

4. 在室溫下以 1,000 rpm (~220g) 離心 5 分鐘。

5. 取出上清液，細胞即可使用。

PBMC 的單熒光團和雙熒光團染色：

前兩節中制備的綴合物和 PBMC 用于以下細胞表面免疫標記方案。

材料：

· 1.PBMC

· 2.HHBS 緩沖液（ 貨號 20011）

· 3.測定緩沖液（含 1% BSA 的 HHBS 緩沖液）

· 4.臺盼藍鈉鹽*超純級*（ 貨號 2452）

· 5.TruStain FcX™CD45 – PE 結合物

· 6.CD45 – APC 綴合物

· 7.CD4 – FITC 綴合物

· 8.CD3 – APC 綴合物

· 9.小鼠 IgG – PE 綴合物

· 10.小鼠 IgG – APC 綴合物

· 11.NovoCyte 3000 流式細胞儀

PBMC 染色：

1. 在免疫標記之前，使用臺盼藍染料排除測試（2452）確定 PBMC 活力，每個樣品使用 100 萬個細胞。

2. 用 HHBS 緩沖液（ 20011）通過離心機以 1000 RPM 洗滌 PBMC 2 次，每次洗滌 5 分鐘。

3. 為了阻斷非特異性 Fc 介導的相互作用，將 PBMC 重懸于含有 1% BSA 溶液的 HHBS 緩沖液和 Human TruStain FcX™ 5 µL/100 µL 檢測緩沖液中，并在室溫10分鐘。

4. 對于單熒光團 PBMC 染色，將 PBMC 與終濃度 0.1 µg 的 CD45-PE、CD45-APC、小鼠 IgG-PE 或小鼠 IgG-APC 在冰上避光孵育 20 分鐘。

5. 對于雙熒光團 PBMC 染色，將 PBMC 與 CD45-PE 和 CD4-FITC 以及 CD45-PE 和 CD3-APC 共孵育。所有四種染料的終濃度均為 0.5 µg，在冰上避光保存 20 分鐘。

6. 用 Assay Buffer 清洗 PBMC 兩次，然后將 PBMC 重懸于 Assay Buffer 中。

7. 在流式細胞儀上進行分析。

使用 Buccutite™ 綴合技術生成的綴合物可提供高質量的產量。這些綴合物在 PBMC 上進行了測試，并且可以靈活地與其他綴合物組合進行多色染色，以檢測 PBMC 中的 CD 標記。

使用 CD45-PE、CD45-APC、CD4-FITC 和 CD3-APC 使用單熒光團和雙熒光團對 PBMC 進行流式細胞術分析。密度圖（最左邊）用于從其他細胞群中排除淋巴細胞。直方圖（右上）和密度圖（右下）分別用于單次和多次熒光團染色。數據記錄在 ACEA Biosciences 的 NovoCyte 3000 流式細胞儀上，并使用 NovoExpress 1.2.5 版進行分析。