一.百螢 ATTO 647N 馬來酰亞胺工作原理

基于羅丹明的 ATTO 647N 是一種紅色熒光標(biāo)記，具有與 Cy5 相似的光譜特性。它具有強(qiáng)吸收、高熒光量子產(chǎn)率以及出色的熱穩(wěn)定性和光穩(wěn)定性。值得注意的是，其吸收和熒光不受 2 至 11 的 pH 值變化的影響。與花青染料不同，ATTO 647N 在大氣臭氧存在下表現(xiàn)出出色的穩(wěn)定性，這使其對(duì)于微陣列應(yīng)用特別有價(jià)值。 ATTO 647N 適合一系列科學(xué)應(yīng)用，包括單分子檢測(cè)、SIM 和 STED 等高分辨率顯微鏡技術(shù)，以及流式細(xì)胞術(shù) (FACS) 和熒光原位雜交 (FISH)。 ATTO 647N 馬來酰亞胺用于標(biāo)記含硫醇的分子，例如蛋白質(zhì)、抗體、配體和寡核苷酸硫代磷酸鹽。

圖1.熒光染料馬來酰亞胺是通過 SH 基團(tuán)將染料與肽、蛋白質(zhì)、抗體、硫醇修飾的寡核苷酸或核酸結(jié)合的常用工具。馬來酰亞胺在中性條件下很容易與蛋白質(zhì)的硫醇基團(tuán)、硫醇修飾的寡核苷酸和其他含硫醇的分子發(fā)生反應(yīng)。所得的染料綴合物相當(dāng)穩(wěn)定。

二.百螢 ATTO 647N 馬來酰亞胺參數(shù)

Ex(nm)    318

Em(nm)    663

分子量    N/

溶劑      DMSO

存儲(chǔ)條件    在-15℃以下保存，避光防潮

三.百螢 ATTO 647N 馬來酰亞胺實(shí)驗(yàn)方案

溶液配制方案

除非另有說明，所有未使用的儲(chǔ)備溶液應(yīng)分成一次性等份，并在制備后儲(chǔ)存在-20°C。避免反復(fù)凍融循環(huán)。

1.ATTO 647N 馬來酰亞胺儲(chǔ)備溶液（溶液 B） ：

將無水 DMSO 添加到 ATTO 647N 馬來酰亞胺小瓶中，制成 10 mM 儲(chǔ)備溶液。通過移液或渦旋充分混合。

注意：

開始綴合前準(zhǔn)備染料儲(chǔ)備溶液（溶液 B）。及時(shí)使用。延長(zhǎng)儲(chǔ)存染料原液可能會(huì)降低染料活性。避光防潮時(shí)，溶液 B 可在冰箱中保存長(zhǎng)達(dá) 4 周。避免凍融循環(huán)。

2. 蛋白原液（A液）

將 100 μL 反應(yīng)緩沖液（例如，pH ~6.0 的 100 mM MES 緩沖液）與 900 μL 目標(biāo)蛋白溶液（例如抗體，蛋白濃度 > 2 mg/mL 如果可能）混合，得到 1 mL 蛋白標(biāo)記庫存溶液。

注1：蛋白質(zhì)溶液（溶液 A）的 pH 應(yīng)為 6.5 ± 0.5。

注2：不純的抗體、穩(wěn)定的牛血清蛋白（BSA）抗體或明膠不會(huì)被很好的標(biāo)記。硫柳汞的存在也可能干擾綴合反應(yīng)。可以通過透析或旋轉(zhuǎn)柱除去硫柳汞，以獲得標(biāo)記結(jié)果。

注3：如果蛋白質(zhì)濃度低于 2 mg/mL，結(jié)合效率會(huì)顯著降低。為了獲得標(biāo)記效率，建議蛋白質(zhì)濃度范圍為 2-10 mg/mL。

可選：如果您的蛋白質(zhì)不含游離半胱an酸，則必須用 DTT 或 TCEP 處理蛋白質(zhì)以生成硫醇基團(tuán)。 DTT 或 TCEP 用于將二硫鍵轉(zhuǎn)化為兩個(gè)游離硫醇基團(tuán)。如果使用 DTT，則必須在將馬來酰亞胺染料與蛋白質(zhì)結(jié)合之前通過透析或凝膠過濾除去游離 DTT。以下是生成游離硫醇基團(tuán)的示例方案：

1.在蒸餾水中制備 1 M DTT (15.4 mg/100 µL) 的新鮮溶液。

2.在 20 mM DTT 中制備 IgG 溶液：混合時(shí)每 ml IgG 溶液添加 20 µL DTT 庫存。在室溫下靜置 30 分鐘，無需額外混合（以盡量減少半胱an酸再氧化為胱an酸）。

3.將還原的 IgG 通過用“交換緩沖液"預(yù)平衡的過濾柱。從柱中收集 0.25 mL 餾分。

4.確定蛋白質(zhì)濃度并將大部分 IgG 的級(jí)分合并。這可以通過分光光度法或比色法來完成。

5.此步驟后盡快進(jìn)行綴合（請(qǐng)參閱示例實(shí)驗(yàn)方案）。

注意：為了獲得結(jié)果，IgG 溶液應(yīng) >4 mg/mL。如果抗體低于 2 mg/mL，則應(yīng)濃縮。額外包括 10% 的緩沖液交換柱損失。

注意：幾乎可以在 pH 7-7.5 的任何緩沖液中進(jìn)行還原，例如 MES、磷酸鹽或 TRIS 緩沖液。

注意：步驟 3 和 4 可以用透析代替。

樣品實(shí)驗(yàn)方案：

該標(biāo)記方案是針對(duì)山羊抗小鼠 IgG 與 ATTO 647N 馬來酰亞胺的綴合物而開發(fā)的。請(qǐng)您根據(jù)您的實(shí)際情況，進(jìn)行操作。

注意：每種蛋白質(zhì)都需要不同的染料/蛋白質(zhì)比例，這也取決于染料的特性。蛋白質(zhì)的過度標(biāo)記可能會(huì)對(duì)其結(jié)合親和力產(chǎn)生不利影響，而低染料/蛋白質(zhì)比率的蛋白質(zhì)綴合物會(huì)降低靈敏度。

運(yùn)行綴合反應(yīng)：

1.使用 10:1 摩爾比的溶液 B（染料）/溶液 A（蛋白質(zhì)）作為起點(diǎn)：將 5 µL 染料儲(chǔ)備溶液（溶液 B，假設(shè)染料儲(chǔ)備溶液為 10 mM）添加到蛋白質(zhì)小瓶中溶液（95 µL 溶液 A）并有效搖動(dòng)。假設(shè)蛋白質(zhì)濃度為 10 mg/mL，蛋白質(zhì)的分子量為 ~200KD，則蛋白質(zhì)濃度為 ~0.05 mM。

注意：我們建議使用溶液 B（染料）/溶液 A（蛋白質(zhì)）摩爾比為 10:1 的溶液。如果太少或太高，則分別確定染料/蛋白質(zhì)比例為 5:1、15:1 和 20:1。

2.繼續(xù)在室溫下旋轉(zhuǎn)或搖動(dòng)反應(yīng)混合物30-60分鐘。

純化綴合：

以下方案是使用 Sephadex G-25 柱純化染料-蛋白質(zhì)綴合物的示例。

1.根據(jù)制造說明準(zhǔn)備 Sephadex G-25 柱。

2.將反應(yīng)混合物（來自“運(yùn)行綴合反應(yīng)"）加載到 Sephadex G-25 柱的頂部。

3.當(dāng)樣品剛好流到頂部樹脂表面下方時(shí)，立即添加 PBS（pH 7.2-7.4）。

4.向所需樣品中添加更多 PBS (pH 7.2-7.4) 以完成柱純化。合并含有所需染料-蛋白質(zhì)綴合物的級(jí)分。

注意：如需立即使用，染料-蛋白質(zhì)綴合物需要用染色緩沖液稀釋，并等分多次使用。

注意：為了長(zhǎng)期儲(chǔ)存，染料-蛋白質(zhì)綴合物溶液需要濃縮或冷凍干燥。