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1.百螢 Cell Meter Caspase3/7/8/9活性細胞凋亡復用檢測試劑盒概述
我們的Cell Meter 檢測試劑盒是一套用于檢測細胞生存力的工具。 有多種參數可用于檢測細胞活力。 胱天蛋白酶被廣泛認為是細胞凋亡的可靠指標。 該特定試劑盒設計為使用三種不同的熒光色同時監視與細胞凋亡有關的四個關鍵半胱天冬酶（caspase-3 / 7、8和9）。 該試劑盒使用DEVD-ProRed，IETD-R110和LEHD-AMC作為分別指示caspase 3 / 7、8和9活性的熒光指示劑。 在半胱天冬酶裂解后，DEVD-ProRed ，IETD-R110和LEHD-AMC半胱天冬酶底物會產生三種不同的熒光團：ProRed （紅色熒光），R110（綠色熒光）和AMC（藍色熒光）。
2.百螢 Cell Meter Caspase3/7/8/9活性細胞凋亡復用檢測試劑盒適用儀器
熒光酶標儀
Ex(nm) 見表一
Em(nm) 見表一
推薦孔板 黑色透明底板
讀取模式 底部/頂部讀取
Caspase | 熒光 | 激發光線(Ex) | 發射光線(Em) |
Caspase3/7 | 紅色 | 535nm | 620nm |
Caspase8 | 綠色 | 490nm | 525nm |
Caspase9 | 藍色 | 370nm | 450nm |
表1. Caspases 3/ 7、8和9的光譜波長
3.百螢 Cell Meter Caspase3/7/8/9活性細胞凋亡復用檢測試劑盒實驗方案
簡要概述
1. 用測試化合物準備細胞
2. 加入等量的半胱天冬酶工作溶液
3. 在室溫下孵育30分鐘至1小時
4. 檢測熒光強度
溶液配制
工作溶液配制
1.單胱天蛋白酶活性工作液：將50 µL底物（組分A，B或C）加入10 mL分析緩沖液（組分D）中，制成caspase 3/7，caspase 8或caspase 9工作溶液，并充分混合。
2.雙胱天蛋白酶或三胱天蛋白酶活性工作液：將每種半胱天冬酶底物50 µL加到10 mL的測定緩沖液（組分D）中，制成工作溶液。 注意：請按比例準備被測底物溶液和所需的體積。
實驗步驟
1.通過向PBS或所需的緩沖液中加入10 µL /孔的10X測試化合物（96孔板）或5 µL /孔的5X測試化合物（384-板）來處理細胞。對于空白孔（不含細胞的培養基），添加相同量的化合物緩沖液。
2.將細胞板在37°C，5％CO2的培養箱中孵育（對于用星形孢菌素處理的Jurkat細胞需要3-5小時）以誘導凋亡。
3.加入100 µL /孔/ 96孔或25 µL /孔/ 384孔的所需caspase分析工作溶液。
4.在避光的條件下，在室溫下孵育平板至少30至60分鐘。注意：如果需要，可在室溫下添加測定上樣溶液10分鐘之前，向選定的樣品中添加1 µL 1 mM caspase抑制劑，以確認對caspase活性的抑制。
5.按照頂部或底部讀取模式，檢測熒光強度。注意：有時，底部讀數可提供更好的信噪比，如果使用底部讀數模式，則以800 rpm的速度離心細胞板（特別是非貼壁細胞）2分鐘（制動）。
圖示：
圖1. Jurkat細胞中胱天蛋白酶活性的檢測。 當天將Jurkat細胞以200,000個細胞/孔的方式接種在Costar黑色96孔板中。用星形孢菌素以1 mM的終濃度處理細胞4小時（紅色條），而未處理的細胞用作對照（藍色條）。 添加單胱天蛋白酶測定加載溶液（100 uL /孔）（對于caspase 3/7在＃1中，對于caspase 8而言在＃2中或對于caspase 9在＃3中）或三次胱天蛋白酶測定加載溶液（對于caspase 3在＃4中 一起添加/ 7、8和9），并在室溫下孵育1小時。 使用FlexStation熒光酶標儀在波長下測量熒光強度。 胱天蛋白酶3 / 7、8和9的活性可以在一次測定中檢測到，而不受其他胱天蛋白酶的干擾。
圖2. cSBL通過caspase途徑誘導H2452和MSTO細胞凋亡。 通過蛋白質印跡法（A，B）或熒光法（C，D）檢測到Caspase-3，-8和-9的活化。 熒光測定法獨立進行三次，數據表示為平均值±SD。 這些實驗與對照相比的統計顯著性顯示如下：* P<0.05，** P <0.01，*** P <0.001。 來源：Tatsuta T等人，PLOS，2018年1月，來自牛蛙卵的唾液酸結合凝集素在體外和體內抑制人惡性間皮瘤細胞生長。
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