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有多種參數可用于檢測細胞凋亡。這種Cell Meter 活細胞半胱天冬酶3/7活性測定試劑盒旨在通過測量活細胞中胱天蛋白酶3/7的活化來檢測細胞凋亡。它用于定量凋亡細胞中活化的caspase 3/7活性，或用于篩選caspase 3/7抑制劑。TF3-DEVD-FMK，紅色標記試劑，允許通過熒光顯微鏡，流式細胞儀或熒光酶標儀直接檢測凋亡細胞中活化的半胱天冬酶3/7。該試劑盒為所有必需組分提供優化的分析方案。
適用儀器
流式細胞儀 | |
參數 | 見表1 |
熒光顯微鏡 | |
推薦孔板： | 黑色透明 |
通道： | 見表1 |
熒光酶標儀 | |
推薦孔板： | 黑色孔板 |
通道： | 見表2 |
表1:用于流式細胞儀和熒光顯微鏡的熒光強度檢測
流式細胞儀 | 熒光顯微鏡 | |
FAM-DEVD-FMK | FL1 通道 | FITC 通道 |
Propidium Iodide | FL2 通道 | TRITC 通道 |
Hoechst Dye | 紫色激光 | DAPI 通道 |
表2:熒光酶標儀的熒光強度檢測
激發 | 發射 | cutoff | |
FAM-DEVD-FMK | FL1 通道 | FITC 通道 | 515nm |
Propidium Iodide | FL2 通道 | TRITC 通道 | |
Hoechst Dye | 紫色激光 | DAPI 通道 |
實驗方案
分離細胞的檢測方案
概述
用測試化合物制備細胞，密度為5×105至2×106個細胞/ mL
將TF3-DEVD-FMK以1：150的比例加入細胞溶液中
在室溫下孵育1小時
沉淀細胞，用緩沖液或生長培養基洗滌并重懸細胞
在Ex / Em = 550 / 595nm處分析細胞
注：使用前將所有部件在室溫下解凍。
操作方法
1.根據您的特異性誘導方案，將細胞培養至適于細胞凋亡誘導的密度，但不超過2 x 106個細胞/ mL。同時，對于每種標記條件，以與誘導群體相同的密度培養非誘導的陰性對照細胞群。以下是一些誘導懸浮培養細胞凋亡的例子：
1）用2μg/ ml喜shu堿處理Jurkat細胞3小時。
2）用1μM星形孢菌素處理Jurkat細胞3小時。
3）用4μg/ ml喜shu堿處理HL-60細胞4小時。
4）用1μM星形孢菌素處理HL-60細胞4小時。
注意：應對每個細胞系進行單獨評估，以確定誘導細胞凋亡的細胞密度。
2.通過向TF3-DEVD-FMK（組分A）的小瓶中加入50μLDMSO制備150X TF3-DEVD-FMK DMSO儲備溶液。 將150×TF3-DEVD-FMK以1：150的比例加入細胞溶液中，并將細胞在37℃，5％CO2培養箱中孵育1小時。
注1：對于TF3-DEVD-FMK標記，細胞可以濃縮至~5×10 6個細胞/ mL。 未使用的150X TF3-DEVD-FMK DMSO儲備溶液應分為單次使用的等分試樣并儲存在-20°C。
注2：對于粘附細胞，用0.5mM EDTA輕輕提起細胞以保持細胞完整，并在用TF3-DEVD-FMK孵育之前用含血清的培養基洗滌細胞一次。
注3：適當的孵育時間取決于所用的細胞類型和細胞濃度。 優化每個實驗的孵育時間。
3.將細胞以約200g旋轉5分鐘，并用1mL洗滌緩沖液（組分B）洗滌細胞兩次。 將細胞重懸于所需量的洗滌緩沖液中。
注1：TF3-DEVD-FMK是熒光的，因此清除任何未結合的試劑以消除背景非常重要。
注2：對于分離的細胞，應將細胞濃度調節至每個微量滴定板孔中2-5×10 5個細胞/100μL等分試樣，用于步驟5。
4.如果需要，用DNA染色標記細胞（例如用于死細胞的Nuclear Green DCS1，或用于細胞核染色的整個群體的Hoechst）。
5.通過熒光顯微鏡，流式細胞儀或熒光酶標儀在Ex / Em = 550/595 nm處檢測熒光強度（對于Nuclear Green DCS1，Ex / Em = 490/525 nm，對于Hoechst染料，Ex / Em = 350/461 nm）
5.1對于流式細胞儀，使用Ex / Em = 550/595 nm（用于Nuclear Green DCS1染色的FL1通道）的通道監測熒光強度。
5.2用于熒光顯微鏡和熒光酶標儀。 將100μL細胞懸浮液置于96孔黑色微量滴定板的每個孔中。
注意：如果需要平衡細胞濃度，調整誘導細胞的懸浮體積以接近非誘導細胞群的細胞密度。 如果您的細胞治療不會導致受刺激細胞群數量的顯著損失，則此調整步驟是可選的。
5.3使用TRITC通道（用于Nuclear Green DCS1染色的FITC通道，用于Hoechst染色的DAPI通道）在熒光顯微鏡下觀察細胞。
5.4使用熒光酶標儀，使用Ex / Em = 550/595 nm（在570 nm處截止）底部讀取模式監測熒光強度。
圖示
圖1。用 Kit # 20100熒光法檢測 Jurkat 細胞中活性半胱天冬酶3/7。細胞用1μM 星形孢素處理3小時(紅色) ，而未處理的細胞用作對照(藍色)。細胞與 FAM-devD-FMK 在37 °C 溫育1小時。使用FlexStation 微板閱讀器使用底部讀取模式在 Ex/Em = 490/525nm (在515nm 處截止)測量熒光強度(300,000個細胞/100μL/孔)。
圖2。使用 FAM-devD-FMK (目錄號20100)熒光法檢測 Jurkat 細胞中活性半胱天冬酶3/7。用1μM 星形孢菌素處理細胞4小時(紅色) ，而未處理的細胞作為對照(綠色)。對照和處理的細胞與 FAM-devD-FMK 在37 °C 溫育1小時，然后在染色后洗滌一次。用 NovoCyteTM 3000流式細胞儀 FITC 通道測量熒光強度。
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