活化的核酸內(nèi)切酶引起的核小體間 DNA 斷裂被普遍認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的生化標(biāo)志。含有這些 DNA 鏈斷裂的細(xì)胞可以通過(guò)末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶 dUTP 缺口末端標(biāo)記(TUNEL)分析來(lái)鑒定。這種成熟的原位染色方法依賴于酶末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(tdT)催化修飾的 dUTPs 與片段化 DNA 的3’-羥基末端的結(jié)合。根據(jù)修飾的 dUTP-BrdUTP，生物S -dUTP 或熒光素 -dUTP- 凋亡細(xì)胞的選擇，可以使用各種檢測(cè)策略和系統(tǒng)(包括熒光顯微鏡，流式細(xì)胞術(shù)和基于熒光的微板研究)來(lái)鑒定和測(cè)量。百螢提供了幾種熒光 TUNEL 分析方法，優(yōu)化后用于在活細(xì)胞或固定細(xì)胞和組織樣品中原位檢測(cè)細(xì)胞凋亡。這些產(chǎn)品可以與其他基于細(xì)胞的活力和細(xì)胞凋亡測(cè)定相結(jié)合，以提供細(xì)胞健康的全面評(píng)估，評(píng)估候選藥物的毒性和安全性，或分析癌癥和疾病相關(guān)的細(xì)胞變化。

1.TUNEL分析原理

在細(xì)胞凋亡的后期階段，半胱天冬酶激活的核酸內(nèi)切酶將基因組 DNA 切割成寡核小體片段(約180-200堿基對(duì)長(zhǎng))。使用 TUNEL 測(cè)定，這些斷裂暴露的3’-OH 末端可以用修飾的 dUTPs 標(biāo)記，以便隨后在原位顯示和定量凋亡細(xì)胞。這通常是直接使用染料修飾的 dUTP 或間接使用 BrdUTP 和抗 BrdUTP 的抗體偶聯(lián)物來(lái)完成的。無(wú)論采用何種標(biāo)記策略，兩者都需要酶末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)催化修飾的 dUTPs 與3’-OH 末端的結(jié)合。

圖1.固定化細(xì)胞和組織 TUNEL 凋亡顯像檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

用這種方法檢測(cè) DNA 片段需要使用交聯(lián)試劑如4% 多聚甲醛(避免使用乙醇為基礎(chǔ)的固定劑，因?yàn)樗璧K了小片段的提取)和樣品透化等樣品固定。這兩個(gè)步驟對(duì) TUNEL 檢測(cè)是至關(guān)重要的，因?yàn)樗龠M(jìn)了外源性 TdT 和抗 BrdUTP 抗體偶聯(lián)物的進(jìn)入。記住幾個(gè)變量影響 TUNEL 分析的染色動(dòng)力學(xué)。其中一些變量，包括試劑濃度、樣品固定和 DNA 鏈斷裂的可及性，可能因組織或細(xì)胞樣品類型而異。使用具有陽(yáng)性和陰性凋亡控制樣品的 TUNEL 檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化可以減輕這些潛在的影響并減少假陽(yáng)性或陰性結(jié)果。

2.活細(xì)胞的TUNEL分析

傳統(tǒng)上，TUNEL 分析需要樣品的固定和透化，以促進(jìn)外源性 TdT 的進(jìn)入，并確保 DNA 鏈斷裂的成功標(biāo)記。雖然對(duì)結(jié)果至關(guān)重要，這種額外的處理需要額外的手的時(shí)間和條件的優(yōu)化，所以結(jié)果是準(zhǔn)確的和可重復(fù)的。細(xì)胞計(jì)數(shù)器活細(xì)胞 TUNEL 細(xì)胞凋亡測(cè)定的目的是確定 DNA 片段沒(méi)有酶 TdT 和額外的處理，隨之而來(lái)的使用。這些檢測(cè)利用了一種專有的膜透性熒光染料，它被動(dòng)地進(jìn)入活細(xì)胞，并選擇性地靶向在細(xì)胞凋亡過(guò)程中形成的 DNA 缺口。熒光標(biāo)記的 DNA 片段可以通過(guò)熒光顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)或基于熒光的微板分析直接觀察到。Cell MeterTM Live Cell TUNEL 細(xì)胞凋亡測(cè)定以兩種發(fā)射顏色(綠色和紅色)可用于其他基于熒光的細(xì)胞功能測(cè)定(例如半胱天冬酶活性測(cè)定和膜聯(lián)蛋白 V 染色測(cè)定)的多參數(shù)分析中的靈活性。

與未處理的對(duì)照相比，用100nM 或1μM 星形孢菌素(SS)處理4小時(shí)的 HeLa 細(xì)胞中 TUNEL 反應(yīng)的熒光圖像。將細(xì)胞與 TUNEL 工作溶液在37 °C 下溫育1小時(shí)。紅色熒光信號(hào)用 TRITC 濾波器組的熒光顯微鏡進(jìn)行分析。熒光標(biāo)記的 DNA 鏈斷裂顯示強(qiáng)烈的熒光染色 SS 處理的細(xì)胞。

3. 固定細(xì)胞和組織樣品的TUNEL分析

按照傳統(tǒng)的TENL方法,對(duì)固定細(xì)胞和組織的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行了優(yōu)化。 在原地 固定細(xì)胞和組織切片細(xì)胞凋亡的檢測(cè)。這些實(shí)驗(yàn)通過(guò)使用TDT催化在片段DNA3'-OH端的染色修飾荷蘭蛋白的結(jié)合,直接識(shí)別群體中的凋亡細(xì)胞。熒光標(biāo)記的DNA片段可以分別用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀進(jìn)行可視化或定量化。細(xì)胞儀中的固定細(xì)胞和組織TINL細(xì)胞凋亡檢測(cè)可以用四種發(fā)射顏色(藍(lán)色、綠色、紅色和深紅色)進(jìn)行靈活的多參數(shù)分析,例如其他熒光蛋白或共軛,例如?河豚素 .

主要特征

用于固定細(xì)胞和固定組織切片中的凋亡檢測(cè)的驗(yàn)證

通過(guò)減少孵化步驟的數(shù)量,直接公司最大限度地減少手的準(zhǔn)時(shí)性

與其他熒光蛋白和共軛的相容性

化驗(yàn)結(jié)果為25次試驗(yàn)提供了足夠的試劑

用細(xì)胞計(jì)組細(xì)胞和組織TINL細(xì)胞凋亡測(cè)定試劑盒*綠色熒光法測(cè)定人肺腺瘤癌切片。DNA鏈斷裂在經(jīng)DNA酶處理的組織切片上顯示出強(qiáng)烈的熒光染色。細(xì)胞核染色為核藍(lán)色。