Configuration-specificMonoclonalAntibodyBasedRhoAActivationAssayKitCatalogNumber：8060120assays產(chǎn)品說(shuō)明小G蛋白是從屬于細(xì)胞調(diào)節(jié)因子中的一個(gè)超家族

詳細(xì)介紹

Configuration-specific Monoclonal Antibody Based

RhoA Activation Assay Kit

Catalog Number：80601

20 assays

產(chǎn)品說(shuō)明

小 G 蛋白是從屬于細(xì)胞調(diào)節(jié)因子中的一個(gè)超家族。Rho 家族是小 G 蛋白中的一個(gè)亞家族，它在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞分裂以及基因轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮主要作用。而本試劑盒中的 RhoA 就屬于Rho 亞家族中的一種， RhoA 參與生理活動(dòng)過(guò)程中其分子結(jié)構(gòu)會(huì)呈現(xiàn)出 2 種相互轉(zhuǎn)換的形式：與 GTP 結(jié)合的激活狀態(tài)和與 GDP 結(jié)合的非活性狀態(tài)。

目前RhoA蛋白活性的檢測(cè)主要是依據(jù)小GTP酶RhoA可以與RhoA效應(yīng)蛋白(Rhotekin)的 RBD 區(qū)域結(jié)合，使 RhoA 效應(yīng)蛋白活化從而發(fā)揮生物學(xué)功能，進(jìn)而間接的進(jìn)行 RhoA 活性功能的監(jiān)測(cè)。然而此方法在檢測(cè)過(guò)程中存在著一定的局限性比如 GTP 水解成 GDP 的速度過(guò)快以及 RhoA-GTP 結(jié)合蛋白與 RBD 結(jié)合區(qū)域之間較低的親和力，導(dǎo)致這種檢測(cè)方法的重復(fù)性較差。

而武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司推出的 RhoA 活性檢測(cè)試劑盒主要是依據(jù)單克隆抗體能夠特異性的識(shí)別特殊構(gòu)象的 RhoA-GTP 結(jié)合蛋白，而不識(shí)別 RhoA-GDP 結(jié)合蛋白，進(jìn)而簡(jiǎn)單并且快速的進(jìn)行 RhoA 的活性檢測(cè)。同時(shí)試劑盒中的 RhoA-GTP 單克隆抗體也可以進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞和組織中 RhoA 的活性監(jiān)測(cè)。每套試劑盒可以進(jìn)行 20 次檢測(cè)。檢測(cè)原理

武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司的 RhoA 活性檢測(cè)試劑盒主要是利用識(shí)別蛋白特異構(gòu)象的 RhoA-GTP 單克隆抗體特異性的去檢測(cè)細(xì)胞提取物或者體外的（樣品需要進(jìn)行 GTPγS 活化處理）活性 RhoA-GTP 的水平。簡(jiǎn)言之，特異性識(shí)別 RhoA 活化構(gòu)象的鼠單克隆抗體可以特異性結(jié)合細(xì)胞裂解液中的 RhoA-GTP 活性蛋白，然后利用 protein A/G 將抗原抗體的結(jié)合物吸附下來(lái)，再利用特異性識(shí)別 RhoA 活化構(gòu)象的兔多克隆抗體進(jìn)行免疫印跡分析進(jìn)行檢測(cè)。

試劑盒成分

1. 特異性識(shí)別 RhoA 活性構(gòu)象的鼠單克隆抗體（Anti-active RhoA, Mouse Monoclonal Antibody (Catalog No. 26904)）：小管裝--30ul (抗體濃度是 1mg/ml)，抗體溶于 PBS（pH7.4）并包含 50%的甘油和 0.05%的。此抗體可以特異性識(shí)別所有脊椎動(dòng)物中的 RhoA-GTP。

2. Protein A/G agarose (Catalog No. 30301) ：小管裝—400ul 包含 200ul Protein A/G agarose和 200ul 20%乙醇溶液。（使用時(shí)溶液需要充分混勻，再吸?。?/p>

3. 5X Assay/Lysis Buffer (Catalog No. 30303)：小瓶裝—30mL 包含 250 mMTris-HCl (pH8.0),750 mM NaCl, 50 mM MgCl2, 5 mM EDTA, 5% Triton X-100。

4. 特異性識(shí)別 RhoA 活性構(gòu)象的兔多克隆抗體（Anti-RhoA, Rabbit Polyclonal Antibody

(Catalog No.21009)）：小管裝--30ul (抗體濃度是 1mg/ml)，抗體溶于 PBS（pH 7.4包含有 50%的甘油。

5. 100 X GTPγS (Catalog No. 30302) ：小管裝—100ul (10 mM) ，實(shí)驗(yàn)中 0.5mL 細(xì)胞裂解液使用 5ul GTPγS 標(biāo)記。

6. 100 X GDP (Catalog No. 30304) ：小管裝—100ul (100 mM) ，實(shí)驗(yàn)中 0.5mL 細(xì)胞裂解液使用 5ul GDP 標(biāo)記。

儲(chǔ)存條件

試劑盒的成分在試劑盒的有效期限內(nèi)必須存放于 4°C 條件下保存。

試劑（試劑盒內(nèi)不提供，由實(shí)驗(yàn)者自行配置）

1. 刺激和未刺激的細(xì)胞裂解物；

2. 蛋白酶抑制劑；

3. 4 °C 搖桿或者搖床；

4. 0.5 M EDTA (pH 8.0)；

5. 1 M MgCl2；

6. 2X reducing SDS-PAGE sample buffer；

7. 電泳和免疫印跡相關(guān)試劑；

8. 免疫印跡緩沖液 TBST (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.05%

Tween-20)；

9. 免疫印跡封閉緩沖液 (TBST containing 5% 脫脂奶粉 or 3% BSA)；

10. PVDF 或硝酸纖維素膜；

11. 二抗；

12. ECL 檢測(cè)試劑；

試劑制備

1X Assay/Lysis Buffer：實(shí)驗(yàn)前用去離子水將 5X 的 Assay/Lysis 緩沖液稀釋成 1X 的緩沖液，

并在使用前加入蛋白酶抑制劑如 1 mM PMSF, 10 µg/mL leupeptin（亮肽素），或 10 µg/mL

aprotinin（）。

樣品處理

貼壁細(xì)胞

1. 培養(yǎng)細(xì)胞密度達(dá)到大約 80%-90%之間（直徑 10 cm 培養(yǎng)皿，~10

7個(gè)細(xì)胞），并用活性劑或抑制劑進(jìn)行處理。

2. 吸去培養(yǎng)基并用冰冷的 PBS 洗滌兩次。

3. 向細(xì)胞中加入 1X Assay/Lysis 緩沖液（每個(gè)直徑 10cm 的組織培養(yǎng)皿中加入 0.5-1mL）。

4. 將培養(yǎng)皿放置于冰上處理 10-20 分鐘。

5. 用細(xì)胞刮棒把細(xì)胞從培養(yǎng)皿下分離下來(lái)。

6. 將細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)入合適的管中并放置于冰上。

7. 如果核發(fā)生裂解，細(xì)胞裂解物可能會(huì)變得非常的粘稠并且難以吸取。當(dāng)這種情況出現(xiàn)時(shí)，

將細(xì)胞裂解物用 27?的注射器針頭來(lái)回吸取 3-4 次，以破壞基因組 DNA，從而避免上述

情況的出現(xiàn)。

8. 4°C 12000 g, 離心 10 min。

9. 收集上清（~1-2 mg 總蛋白）并放置于冰上使用。如果樣品不立即使用，請(qǐng)將處理后的

樣品存放于-70°C 條件下。

懸浮細(xì)胞

1. 培養(yǎng)細(xì)胞并用活化劑或抑制劑進(jìn)行處理。

2. 計(jì)數(shù)細(xì)胞后離心。

3. 吸去培養(yǎng)基并用冰冷的 PBS 洗滌兩次。

4. 向細(xì)胞中加入 1X Assay/Lysis 緩沖液（每個(gè)直徑 10cm 的組織培養(yǎng)皿中加入 0.5-1mL）。

5. 反復(fù)吹打細(xì)胞進(jìn)行裂解。

6. 將細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)入合適的管中并放置于冰上。

7. 如果核發(fā)生裂解，細(xì)胞裂解物可能會(huì)變得非常的粘稠并且難以吸取。當(dāng)這種情況出現(xiàn)時(shí)，

將細(xì)胞裂解物用 27?的注射器針頭來(lái)回吸取 3-4 次，以破壞基因組 DNA，從而避免上述

情況的出現(xiàn)。

8. 4°C 12000 g, 離心 10 min。

9. 收集上清（~1-2 mg 總蛋白）并放置于冰上使用。如果樣品不立即使用，請(qǐng)將處理后的

樣品存放于-70°C 條件下。

體外用 GTPγS/GDP 處理蛋白以用作陽(yáng)性和陰性的對(duì)照

注意：在細(xì)胞體內(nèi)環(huán)境條件下大約有 10%的 RhoA 被激活，而在體外用 GTPγS 處理大約有

90%的 RhoA 被激活。

1. 準(zhǔn)備兩個(gè)離心管，每個(gè)管中各加入 0.5 mL 的細(xì)胞提取物（如果是純的 RhoA 蛋白則每

個(gè)管中加入的蛋白量為 1ug）。

2. 每個(gè)管中加入 20ul 0.5M EDTA(終濃度即為 20 mM)。

3. 一個(gè)管中加入 5ul 的 100X GTPγS（終濃度即為 100 uM）作為陽(yáng)性對(duì)照。另一個(gè)管中加

入 5ul 的 100X GDP（終濃度即為 1 mM）作為陰性對(duì)照。

4. 將離心管置于 30°C 條件下反應(yīng) 30 min 并不斷攪動(dòng)。

5. 終止反應(yīng)：將管置于冰上并加入 32.5ul 1M MgCl2(終濃度即為 60mM)。

檢測(cè)步驟

Ι. 活性 RhoA Pull-Down 實(shí)驗(yàn)

1. 等分 0.5-1 mL 的細(xì)胞裂解物至微量離心管中。

2. 向管中加入 1mL 的 1X Assay/Lysis 緩沖液。

3. 向管中加入 1ul 的活性 RhoA 單克隆抗體。

4. 用渦旋振蕩儀將 protein A/G 凝膠柱充分混勻，然后快速的吸出 20ul 懸浮珠漿液加入離心

管中。

5. 將管置于 4°C 條件下孵育 1H，并輕輕的進(jìn)行搖動(dòng)。

6. 5000g，離心 1 分鐘。

7. 棄上清，這一步要非常小心以避免珠子的損失。

8. 用 0.5 mL 的 1X Assay/Lysis 緩沖液洗滌珠子三次，離心并棄去上清。

9. 次洗滌后，小心的移去所有的上清。

10. 用 20ul 的 2X SDS-PAGE 樣品緩沖液重懸樣品。

11. 樣品煮沸 5min。

12. 5000g，離心 10s。

II. 電泳和轉(zhuǎn)膜

1. 取 15ul 樣品/孔上樣 17%配體膠。

2. 按照制造商的說(shuō)明進(jìn)行 SDS-PAGE。

3. 按照制造商的說(shuō)明將凝膠蛋白轉(zhuǎn)到 PVDF 或硝化纖維素膜。

III. 免疫印跡反應(yīng)和檢測(cè)（所有步驟都是在室溫下進(jìn)行，并不斷攪拌）

1. 將 PVDF 膜浸入 99%甲醇 15s，然后在室溫放置 5 min 晾干。

注意：如果使用的是硝化纖維素膜，此步省略。

2. 封閉：用 TBST 緩沖液配制 5%的脫脂牛奶或者 3%BSA 在室溫下孵育 1H 進(jìn)行封閉，并

需要恒定振蕩。

3. 孵育一抗：用 TBST 緩沖液配制的 5%脫脂牛奶或 3%BSA 稀釋特異性識(shí)別 RhoA 活性構(gòu)

象的兔多克隆抗體（稀釋比例為 1:50-1:1000，主要根據(jù)樣品中含有的 RhoA 蛋白的量），

室溫下孵育 1-2 小時(shí)，或者 4°C 條件下過(guò)夜孵育。

4. 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。

5. 孵育二抗：（例如羊抗兔 IgG-HRP），用 TBST 緩沖液配制的 5%脫脂牛奶或 3%BSA 按

1:1000 稀釋比例稀釋后使用，室溫下孵育 1 小時(shí)并恒定振蕩。

6. 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。

7. 使用實(shí)驗(yàn)者所選擇的檢測(cè)方法進(jìn)行顯色如 ECL 顯色法。

示例結(jié)果

下圖展示的是武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司的 RhoA 活性試劑盒的典型結(jié)果。下面的數(shù)據(jù)僅

供參考。

Rho 活性分析。小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）用血小板衍生因子（PDGF）處理（Lane 2）

和未處理（Lane 1）。細(xì)胞裂解物用特異性識(shí)別 RhoA 活性構(gòu)象的鼠單克隆抗體(Cat. # 26904)

孵育(上圖)。活性 RhoA 珠子顆粒用特異性識(shí)別 RhoA 活性構(gòu)象的兔多克隆抗體(Cat # 21009)

進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)。底部的圖展示的是細(xì)胞裂解液的活性 RhoA 的 Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

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