正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定                                             

測定意義：

類黃酮是植物次生代謝產物，糖基化是類黃酮基本結構形成的最主要的修飾反應之一，提高了類黃酮苷元的化學穩定性，這一過程主要由類黃酮糖基轉移酶催化的，使類黃酮-OH與UDPG反應，是黃酮合成途徑中的關鍵酶。

測定原理：

類黃酮糖基轉移酶催化花青素與尿苷二磷酸葡萄糖反應產生花青苷，主要以矢車菊素3-葡萄糖苷（C3G）形式存在，用HPLC檢測產物可反映類黃酮糖基轉移酶的酶活性。

組成：

試劑一：粉劑×1瓶，4℃避光保存。臨用前加全部試劑三溶解。

自備儀器和用品：

天平、研砵、離心機、恒溫水浴鍋、100目篩、高校液相色譜、針頭過濾器（水系、0.22μm）、濾膜（水系、0.45μm）、耐水C18柱（4.6×250mm）、樣品瓶、甲酸、甲醇（色譜級）、超純水

酶液提取:

組織：按照組織質量（g）：提取液體積(ml)為1：2~5的比例（建議稱取約0.5g組織，加入1ml提取液），進行冰浴勻漿。10000g ，4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

實驗前的準備工作：

1、檢測產物制備

2、將500 ml超純水和500 ml甲醇用0.45 μm的濾膜抽濾，以除去溶劑中的雜質，防止堵塞色譜柱。（注：蒸餾水用水系濾膜抽濾，甲醇用有機系濾膜抽濾）。

3、流動相的配制：流動相A為1.6%甲酸水溶液； 流動相B為1.6%甲酸甲醇溶液。

4、將配好的流動相超聲30分鐘，以脫去溶劑中的氣泡，防止堵塞色譜柱。

5、標準品的配制：

在標準品中加入1ml甲醇，配成5μmol /ml 母液，將母液用甲醇分別稀釋成2μmol/ml ，1μmol/ml 、0.5μmol/ml 、0.25μmol/ml、0.125μmol/ml的標準品溶液。針頭式過濾器過濾后待測。

測定操作表：

1. 開啟電腦、檢測器和泵，安裝上色譜柱，打開軟件，在方法組中設置進樣量10 μl，梯度洗脫為0~5min，85%A+15%B; 5~10min，85%A+15%B; 10~30min，80%A+20%B; 30~30.1min， 60%A+40%B; 30.1~40min，0%A+100%B。流速1ml/min，柱溫30℃，走樣時間為50min，檢測波長530nm，設置完畢保存方法組。

2.初始設置流動相A=85%，流動相B=15%，流速1 ml/min，待基線穩定后開始加樣。

3.加入標準品10 μl，在50min內可分離C3G，C3G的保留時間在25min左右，（柱子不同，保留時間有差異），計算不同濃度的C3G標準品的峰面積。

4. 加入樣品10 μl，在相應保留時間處檢測C3G的峰面積。

酶活計算：

1. 以標準品濃度（μmol/ml）為橫坐標，峰面積為縱坐標計算C3G標準曲線。將樣品峰面積代入標準曲線，計算樣品C3G含量。

2. 酶活單位定義：

A． 每毫克組織蛋白每分鐘催化反應產生1μmolC3G定義為一個酶活單位。

UFGT活性（μmol/min/mg prot）= C×V反總÷（V樣×Cpr）÷ T=0.117×C÷Cpr                             

B． 每克組織每分鐘催化反應產生1μmolC3G定義為一個酶活單位。

UFGT活性（μmol/min/g 鮮重）= C×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷ T=0.117×C÷W      

C：C3G濃度，μmol/ml ；V反總：反應總體積，0.35ml；V樣：加入樣本量，0.1ml，V樣總：加入提取液體積，1ml，Cpr：蛋白含量，mg/ml；W：樣本質量，g，T：反應時間，min

注意事項：

1、流速由小到大調節，避免柱壓過大。

2、使用完畢時，先用50%的甲醇水溶液洗色譜柱45min，再用純甲醇沖洗色譜柱30min。

標準品的稀釋倍數要根據樣品中C3G濃度確定，樣品中C3G的峰面積必須落在不同濃度的C3G標準品的峰面積之內，該標準品稀釋倍數只是一個參考。