D-熒光素專題

原理

D-熒光素（D-Luciferin）是熒光素酶（Luciferase）的常用底物，普遍應用于整個生物技術領域，尤其是體內活體成像技術。其作用機制是在ATP和熒光素酶的作用下，熒光素（底物）能夠被氧化發光。當熒光素過量時，產生的光量子數與熒光素酶的濃度呈正相關性（見下圖）。

將攜帶熒光素酶編碼基因（Luc）的質粒轉染入細胞后，導入研究動物如大、小鼠體內，之后注入熒光素，通過生物發光成像技術（BLI）來檢測光強度變化，從而實時監測疾病發展狀態或藥物的治療功效等。也可以利用ATP對此反應體系的影響，根據生物發光強度的變化來指示能量或生命體征。

分類

使用方法

（1）體外實驗：

a：儲存液配置：將1 g的D-Luciferin, sodium salt或鉀鹽溶解于33.3 ml水中，制備成30 mg/ml的儲存液?；靹颍?.2μm濾膜過濾（可吹入惰性氣體，如氮氣，以防止氧化。）-80℃避光保存，一年內有效。

b：使用：①在冰上避光解凍（若是在冰上比較難解凍，可短暫溫浴，并輕柔混勻）。②用培養基以1:200的比例稀釋儲存液為150μg/ml。③去除培養細胞的培養基直至無殘留。④待圖像分析前，向細胞內添加1×熒光素工作液，然后進行圖像分析（或者細胞放在37℃短時間孵育約5min后檢測可增強信號）

（2）活體成像：

a：工作液配置：①溶解1 g熒光素鉀鹽或鈉鹽于66.6 ml 無Ca²⁺和Mg²⁺的DPBS中，配置成15 mg/ml的溶液。②混勻，0.2μm濾膜過濾（可吹入惰性氣體，如氮氣，以防止氧化。）-80℃避光保存，一年內有效。

b：使用：①在冰上避光解凍（若是在冰上比較難解凍，可短暫溫浴，并輕柔混勻）。

②按照動物體重150 mg/kg進行注射，（例如，20 g重的小鼠需要注射200μl ）

③注射入體內10-20 min（待光信號達到穩定平臺期），再進行成像分析。

注：建議對每只動物模型都需要建立熒光素酶動力學曲線，從而確定最高信號檢測時間和信號平臺期。

注射方法

（1）腹腔注射：

將底物注射入腹腔中。推薦劑量為150 mg/Kg（例如，20 g重的小鼠需要注射200μl ）。使用25 G的針頭，1 ml注射器。

其方法如下示意圖：

進針5 mm，斜向上30^°角。

（2）靜脈注射：

小鼠的靜脈注射通常是在小鼠的尾部或者眼眶靜脈注射。靜脈注射的推薦劑量同腹腔注射，150 mg/Kg。注射液體的最大體積不可超過血容量的10%。一般對于20 g 小鼠其血容量為2 ml，故其最大注射量應為200μl。使用1 ml注射器26 G針頭，或者使用胰島素注射器28 G針頭，確保注射器中無氣泡。注射前將動物置于加熱燈下約5 min，或者將尾巴浸泡于溫水中以擴張血管。操作時將小鼠固定于鼠筒或者燒杯中，乙醇消毒尾部，緩慢注射。

客戶實例

TIPE2抗炎因子在乳腺癌動物模型中的抗腫瘤治療作用

選自文獻：Zhang Z, Li L, Cao S, et al. Gene delivery of TIPE2 inhibits breast cancer development and metastasis via CD8 +, T and NK cell-mediated antitumor responses[J]. Molecular Immunology, 2017, 85:230.

FAQ

Q1: 熒光素的純度對實驗有成影響嗎？

A：有影響。99%以上的純度較好。

Q2: 甲蟲熒光素和螢火蟲熒光素之間有區別嗎？

A：二者之間沒有區別。

Q3: 如何溶解熒光素，其溶液穩定嗎？

A：熒光素鉀鹽在水中的溶解度為60 mg/ml，D-Luciferin, sodium salt溶解度為100 mg/ml。熒光素游離酸是不溶于水的，但是在甲醇中的溶解度為10 mg/ml，在DMSO中溶解度為50 mg/ml。

D-Luciferin, sodium salt和鉀鹽的水溶液短期內存放于-80℃，對實驗效果沒有明顯影響。有實驗證明，將熒光素溶解于脫氧中的水中會更穩定些。

對于一些較為敏感的試驗，為了控制試驗中的可變因素，較推薦新鮮配置的反應液 。例如，低濃度的熒光素酶或者并非最適的反應條件是需要高質量的底物才能進行反應  。

Q4: D-Luciferin, sodium salt和熒光素鉀鹽有什么區別？

A：目前的研究沒有發現二者在使用效果上的區別，僅在物理特征上有些小的差別，如D-Luciferin, sodium salt鹽溶解度會高于熒光素鉀鹽。但是在體內實驗研究中，有更多的研究者傾向于選擇熒光素鉀鹽，據不統計，選用鉀鹽的使用人是鈉鹽使用人的3倍。

Q5: D-Luciferin, sodium salt，熒光素鉀鹽，和熒光素游離酸之間有什么區別？

A：游離酸不溶于水，在甲醇中的溶解度為10 mg/ml，在DMSO中溶解度為50 mg/ml，同樣可用 NaOH，KOH弱堿去調節溶液的PH值。熒光素的鈉鹽或者鉀鹽在使用過程中會更方便，尤其是在體內成像實驗中，因其能夠溶解在水中，反應毒性也會更小些。

Q6: 為什么溶解D-Luciferin, sodium salt或者鉀鹽的時候需用不含Ca2+或Mg2+離子的PBS，有無別的鹽溶液可用來溶解熒光素？

A：PBS，或者其他的磷酸鹽緩沖液，或DPBS，常用來進行生物學研究或者細胞相關研究。PBS/DPBS為等滲溶液，PH為7.2-7.6之間。DPBS和PBS之間無差別，只是通常情況下，DPBS是不含鈣鎂離子。鈣鎂離子可能會抑制某些蛋白酶的活性。此外Mg²⁺是催化熒光氧化的重要因素，Ca²⁺是和腔腸素氧化有關的離子。其他的鹽溶液也可用來溶解熒光素，但要避免溶液中的陽離對實驗造成影響。

Q7: 熒光素酶的發光特性？

A：熒光素腹腔注射老鼠后約1 min后，能夠表達熒光素酶的細胞開始發光，10 min后強度達到穩定的最高點，在最高點持續約20-30 min后開始衰減，約3 h后熒光素排除，發光全部消失，檢測時間是在注射后15-35 min內。其動力學曲線如下圖：

Q8: 怎么將熒光素注入小鼠體內，注射方法之間的區別是什么？

A：熒光素可通過腹腔注射或尾部靜脈注射注入小鼠體內。約1 min可擴散到小鼠全身。大部分情況下使用熒光素濃度為150 mg/kg。對于20 g的小鼠約使用3 mg的熒光素即可。對于腹腔注射來講，擴散較慢，開始發光較慢，持續發光時間較長。對于熒光素的尾部靜脈注射，擴散快，開始發光快，但發光持續時間較短。

Q9: 熒光素底物可以透過血腦屏障嗎？

A：熒光素底物約280道爾頓，熒光素的水溶性和脂溶性都非常好，很容易穿透細胞膜和血腦屏障。

Q10: 熒光素酶的表達穩定性如何？

A：通過穩定篩選等過程，熒光素酶基因是能夠插到細胞染色體內的。當細胞進行分裂、轉移、分化時，熒光素酶也得到持續穩定的表達，熒光素酶的半衰期約為3 h，故只有活細胞才能持續表達熒光素酶。

注意：建議對每只動物模型都需要建立熒光素酶動力學曲線，從而確定最高信號檢測時間和信號平臺期。保存和操作的過程中都要避光。另外水溶性儲存液過濾除菌后，可以-20℃或-80℃分裝凍存，避免反復凍融。如果有條件，對儲存液充氮氣或氬氣（防止氧化），穩定性和保存時間更長，長達1年。 注射方式，動物類型以及體重等都會影響信號的發射，因此建議每次實驗都要做熒光素酶動力學曲線，確定最佳信號平臺期和最佳的檢測時間。熒光素鉀鹽和鹽應用上沒有差別，兩者的差別在于物理性狀上如外形和溶解性。鈉鹽的水溶性高于鉀鹽。從目前發表的文獻來看，鉀鹽的使用率遠高于鈉鹽，尤其是體內實驗。兩者功效相同。 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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