溶液和試劑

裂解緩沖液

這些緩沖液可在 4 ℃ 下保存數周，或者以分裝形式在 -20 ℃ 下保存長達 1 年。

Nonidet-P40 (NP40) 緩沖液

150 mM NaCl

1.0% NP40（可用 0.1% Triton X-100 替代）

50 mM Tris-HCl pH 8.0

蛋白酶抑制劑（一定要添加，推薦 cocktail 形式的，貨號 A10004）

RIPA 緩沖液（放射免疫沉淀試驗緩沖液）

150 mM NaCl

1.0% NP-40 或 0.1% Triton X-100

0.5% 脫氧膽酸鈉

0.1% SDS（十二烷基硫酸鈉）

50 mM Tris-HCl pH 8.0

蛋白酶抑制劑（一定要添加，推薦 cocktail 形式的，貨號 A10004）

Tris-HCl 緩沖液

20 mM Tris-HCl pH 7.5

蛋白酶抑制劑（一定要添加，推薦 cocktail 形式的，貨號 A10004）

電泳、轉膜、封閉緩沖液

Laemmli 2×緩沖液/上樣緩沖液

4% SDS

20% 甘油

0.004% 溴酚藍

0.125 M Tris-HCl

測定 pH 并調節至 pH 6.8。

電泳緩沖液（Tris-ganansuan/SDS）

25 mM Tris 堿

190 mMganansuan

0.1% SDS

測定 pH，pH 應為約 8.3。必要時進行調節。

轉膜緩沖液（濕轉）

25 mM Tris 堿

190 mM ganansuan

20% 甲醇

測定 pH，pH 應為約 8.3。必要時進行調節。

對于大于 80 kDa 的蛋白質，推薦加入最終濃度為 0.1% 的 SDS。

轉膜緩沖液（半干轉）

48 mM Tris

39 mMganansuan

20% 甲醇

0.04% SDS

封閉緩沖液

5% 奶粉（推薦使用，也可以用 BSA 牛血清白蛋白）

加入 TBST 緩沖液中。混勻并過濾。過濾失敗可能導致出現“斑點"，其中微小的黑色顆粒

會在顯色過程中污染印跡。

實驗步驟

A. 制備細胞裂解物

1. 吸干培養基。添加含有調節分子的新鮮培養基，使其在預定的時間內對細胞進行處理。

2. 收集細胞，去除培養基后用冰預冷的 1X PBS 洗滌細胞一次。

3. 去除 PBS，并在并在細胞培養容器中加入適量的已經添加了 Cock tail 蛋白酶抑制劑的

Lysis buffer。每 107 個細胞加入 1ml 冰預冷的 Lysis buffe（相當于 100mm 的培養皿，150cm2

的培養瓶），并在冰上孵育至少 5 分鐘。

4. 從板上刮下細胞，把提取物轉移至微量離心管。置于冰上。

5. 在冰上進行 3 次超聲破碎，每次 5 秒。如果沒有超聲儀，請用帶注射器的針頭(20G-18G-

16G)冰上反復抽吸，直到裂解液澄清；

6. 在 4°C，在 14,000 x g 條件下，微量離心 10 分鐘，將上清轉移到新管中。上清液即為細胞裂解物。如有必要，裂解物可保存在 –80°C。

注：細胞裂解物制備好之后，可先進行蛋白免疫印跡法檢測，以此來確定細胞裂解物里存在

目標蛋白。

B. 抗原抗體結合

1. 在新的離心管內加入 500μl（含總蛋白 200-1000ug）細胞裂解物。

2. 加入目標蛋白的單克隆/多克隆抗體（1-10μg，根據抗體使用說明書）。

3. 同時采用非特異免疫的同源抗體作為對照。

4. 在 4℃輕柔混合過夜。

C. 免疫復合物沉淀

1. 抗體孵育過夜后，加入 20μl Protein A/G。

2. 在 4℃溫和地混勻 1-3 小時或過夜。

3. 12000g 離心 1min，保留沉淀。

4. 使用 0.5ml 1*Wash buffer 清洗沉淀，12000g 離心 1min，保留沉淀。

5. 重復第 4 步，共計清洗 3 次。

注：清洗，去上清的時候需要注意避免吸走填料

D. 用蛋白免疫印跡法進行分析

1. 在 20-50 μl 1* SDS 樣品緩沖液中重懸沉淀物。渦旋振蕩，然后再微量離心 30 秒。

2. 將樣品加熱至 95–100°C 并持續 2-5 分鐘，然后在 14,000 x g 下瞬時離心 1 分鐘。

3. 將樣品 (15-30 μl) 上樣到 SDS-PAGE 凝膠上。

4. 用蛋白質印跡法分析樣品。

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