 |
南京億迅生物科技有限公司
主營產(chǎn)品： 質(zhì)控樣品,人工血清,人工胃液,elisa試劑盒,化學(xué)試劑,生物試劑 |
聯(lián)系電話
13047500758
公司信息
- 聯(lián)系人：
- 聞經(jīng)理
- 電話：
- 025-65010873
- 手機：
- 13047500758
- 傳真：
- 地址：
- 江蘇省南京市江寧高新園
- 郵編：
- 個性化：
- www.yixunbio.com
組織細胞蛋白提取
2020-10-11 閱讀(942)
組織細胞蛋白提取
描述：從組織細胞中提取總蛋白是 Western Blot 的關(guān)鍵步驟。實體軟組織如腦脊髓富含磷脂，神經(jīng)xue管含大量結(jié)締組織，而脂肪則含有大量油脂，常規(guī)的方法難以有效從這些組織中提取蛋白。本試劑盒為組織或培養(yǎng)細胞總蛋白提取提供完整的解決方案。用裂解-結(jié)合緩沖液勻漿裂解實體組織，或直接用裂解-結(jié)合緩沖液重懸培養(yǎng)細胞，然后加入抽提試劑去除非蛋白成分，離心、干燥后即可得到總蛋白。蛋白沉淀溶解后用常規(guī)方法進行蛋白定量。提取過程可在 30-60 分鐘內(nèi)完成，可在 1.5mL 離心管微量提取也可大規(guī)模制備，極為簡便高效。
規(guī)格： 50次 100次
儲存：室溫或4ºC 24個月有效
操作步驟：
固體組織蛋白提取
1. 每 10-100mg 固體組織剪碎后加入 0.5-1 mL 裂解液，放入玻璃勻漿器內(nèi)上下手動勻漿 15 次；或用高速機械勻漿器 12,000 rpm破碎組織。少量小的未破碎組織不影響后續(xù)抽提。注意：肝腎脾組織蛋白含量高，提取時應(yīng)加較少量的組織，一般不超過50 mg，否則形成的蛋白膜厚、致密且難溶。
2. 僅取 0.5mL 組織勻漿液轉(zhuǎn)移到 1.5mL 離心管，棄去剩余的組織勻漿液。每 0.5mL 組織勻漿液加入2倍體積的(1mL)抽提試劑充分混勻。室溫或 4ºC 靜置 10 分鐘，偶爾晃動。注意：(1)如組織量<10mg，在下一步離心時形成的蛋白膜易碎，靜置 30min 有助蛋白膜形成。(2)提取脂肪組織時應(yīng) 4ºC 靜置 40min 以上以充分去除油脂。(3) 0.5mL 組織勻漿液獲得的蛋白足以進行幾十次 Western Blot。保證每 0.5mL 組織勻漿液加入 2 倍體積的(1 mL)抽提試劑是成功的關(guān)鍵。
3. 10,000 × g 4ºC 離心 10 分鐘，溶液分為上下兩相，兩相中間為蛋白膜。吸除上層液體；隨后用吸頭或針頭輕輕撥開蛋白膜，吸除下層液體。蛋白膜將附著于離心管壁。注意：(1)離心速度過高將使蛋白膜過于堅固，難以溶解。(2)如果不 能分相，可再加入 50μl 蒸餾水混勻離心。 (3)如果初始組織量較少(<10mg)，離心后難以得到完整的蛋白膜，此時可吸
3.去上下層液體，加入 1mL 純乙醇混勻，10,000 × g 4ºC 離心 3 分鐘。棄所有液體，蛋白沉淀在管底。
4. 敞開管口，室溫空氣干燥沉淀。未溶解的蛋白沉淀不含鹽、去垢劑、和還原劑成分，可 4ºC 或－20ºC 一年以上。
說明
1. 按照上述提取和溶解過程，不加蛋白酶抑制劑，而蛋白不會有明顯降解，用戶不必(但可以)加入蛋白酶抑制劑。
2. 蛋白定量。注意使 SDS 濃度稀釋到不影響蛋白定量的水平，或選擇不受 SDS 影響的 BCA 定量方法。BCA 法<5% SDS濃度，Bradford 法<0.125% SDS 濃度。
3. 按比例可進行大規(guī)模的(多至1 g) 組織蛋白提取。
培養(yǎng)細胞蛋白提取 (參見固體組織蛋白提取程序中的斜體字注解)
1. 消化洗滌并 800 g 離心收集細胞。每 5-10 × 106 細胞加入 0.5 mL 裂解液，振蕩重懸，4ºC 凈置 2 分鐘。
2. 按比例每 0.5 mL 裂解液加入 1 mL 抽提試劑，振蕩混勻。4ºC 靜置 10min。
3. 10,000g 4ºC 離心 10 分鐘，溶液分為兩相，兩相中間為蛋白膜。小心吸除上層相和大部分下層相，保留兩相中間的蛋白絮狀物。如果不能分相，可再加入 50μl 蒸餾水混勻離心。
4. 加入 1 mL 純乙醇洗滌沉淀。10,000g 4ºC 離心 3 分鐘，蛋白沉淀在管底。
5. 去除管中所有液體，敞開管口，室溫空氣干燥蛋白沉淀。未溶解的蛋白沉淀不含鹽、去垢劑、和還原劑成分，可4ºC或－20ºC 一年以上。
