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細(xì)胞冷凍步驟及注意事項(xiàng)

2025-4-27  閱讀(80)

步驟:

(1)冷凍前24-48小時(shí)更換半量或全量培養(yǎng)基,使細(xì)胞處于指數(shù)生長(zhǎng)期。

(2)配制冷凍保存溶液(使用前配制):另取一離心管,加入培養(yǎng)基、血清,逐滴加入二甲基亞砜(DMSO)至20%濃度,即制成雙倍的凍存液,置于室溫下待用。

(3)離心收集培養(yǎng)之細(xì)胞,用加血清的培養(yǎng)基重懸起細(xì)胞,取少量細(xì)胞懸浮液(約0.1ml)計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度及凍前存活率。

(4)取與細(xì)胞懸液等量的凍存液,緩慢逐滴加入細(xì)胞懸液,并晃動(dòng)試管,制成細(xì)胞凍存懸液(DMSO最后濃度為5~10%),使細(xì)胞濃度為1~5×106cells/ml,混合均勻,分裝于已標(biāo)示全之冷凍保存管中,1~2ml/vial,并取少量細(xì)胞懸浮液作污染檢測(cè)。嚴(yán)密封口后,注明細(xì)胞名稱、代數(shù)、日期。然后進(jìn)行凍存。

注意事項(xiàng):

(1)欲冷凍保存之細(xì)胞應(yīng)在生長(zhǎng)良好(logphase)且存活率高之狀態(tài),約為80~90%致密度。冷凍前檢測(cè)細(xì)胞是否仍保有其te有性質(zhì),例如hybridoma應(yīng)在冷凍保存前一至二日測(cè)試是否有抗體之產(chǎn)生。

(2)細(xì)胞在液氮中可長(zhǎng)期凍存無限shi間,而不會(huì)影響細(xì)胞活力;在-70度可保存數(shù)月。

(3)注意冷凍保護(hù)劑之品質(zhì)。DMSO應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí),無菌且無色(以0.22micron FGLP Telflon過濾或是直接購(gòu)買無菌產(chǎn)品,如Sigma D-2650),以5~10ml小體積分裝,4℃避光保存,勿作多次解凍。Glycerol亦應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí),以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開啟后一年內(nèi)使用,因長(zhǎng)期儲(chǔ)存后對(duì)細(xì)胞會(huì)有毒性。本方法中先制備雙倍凍存液,可避免DMSO直接加入時(shí)釋放的熱量對(duì)細(xì)胞的損傷。緩慢逐滴加入細(xì)胞懸液是使細(xì)胞逐步適應(yīng)高滲,可降低細(xì)胞受損。DMSO可能引起部分白血病細(xì)胞株的分化,可換用10%甘油凍存。




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