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Tth DNA聚合酶本酶來源于嗜熱菌Thermus thermophilus HB8。在有Mg2+等二價(jià)陽離子存在的情況下，具有DNA多聚酶活性。它與Taq酶一樣被廣泛用于PCR反應(yīng)，但耐熱性比Taq酶高，因此對高GC含量模板的PCR也有較好的效果。本酶基本上沒有3'→5'外切酶活性及5'→3'外切酶活性，所以也可用于雙脫氧法測序。另外，本酶具有RTase 活性，在Mn2+存在的情況下，RTase
Tth DNA聚合酶
名稱 | 規(guī)格 | 價(jià)格 | 手冊 |
Tth DNA聚合酶 | 250U | 詢價(jià) |
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本酶來源于嗜熱菌Thermus thermophilus HB8。在有Mg2+等二價(jià)陽離子存在的情況下，具有DNA多聚酶活性。它與Taq酶一樣被廣泛用于PCR反應(yīng)，但耐熱性比Taq酶高，因此對高GC含量模板的PCR也有較好的效果。本酶基本上沒有3'→5'外切酶活性及5'→3'外切酶活性，所以也可用于雙脫氧法測序。另外，本酶具有RTase 活性，在Mn2+存在的情況下，RTase活性會(huì)得到強(qiáng)化。利用該特性，可以用來在同一管中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR反應(yīng)，即一步法RT PCR。（但是，在Mn2+存在時(shí)，RT-PCR的準(zhǔn)確性不高）此外，本酶與Taq DNA多聚酶一樣，PCR產(chǎn)物可通過T載體進(jìn)行TA克隆。它具有下列特點(diǎn)：
1. RT-PCR反應(yīng)的特異性增加：在較高的溫度下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，增加了引物雜交和延伸的特異性。
2. 二級結(jié)構(gòu)減少：在較高的溫度下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，減少了由于RNA二級結(jié)構(gòu)引起的問題。
RNA提取法：試劑中的主要成分為異硫氰酸胍和苯酚，其中異硫氰酸胍可裂解細(xì)胞，促使核蛋白體的解離，使RNA與蛋白質(zhì)分離，并將RNA釋放到溶液中。當(dāng)加入氯時(shí)，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA進(jìn)入水相， 離心后可形成水相層和有機(jī)層，這樣RNA與仍留在有機(jī)相中的蛋白質(zhì)和DNA分離開。水相層(無色)主要為RNA，有機(jī)層(黃色)主要為DNA和蛋白質(zhì)。
實(shí)驗(yàn)步驟：
1、RNA的提取;
2、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA;
3、PCR擴(kuò)增;
4、產(chǎn)物的電泳和結(jié)果的測定。
RT-PCR是將RNA的反轉(zhuǎn)錄(RT)和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增(PCR)相結(jié)合的技術(shù)。首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成 cDNA，再以cDNA為模板，擴(kuò)增合成目的片段。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進(jìn)行。在兩步法RT-PCR中，每一步都在zui條件下進(jìn)行。
堿變性提取質(zhì)粒DNA是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離目的。在pH高達(dá)12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性。質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)*分離，當(dāng)以pH4.8的NaAc高鹽緩沖液去調(diào)節(jié)其pH至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)原來的構(gòu)型，保存在溶液中，而染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去。
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