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PCR反應開始前的準備工作及操作步驟
2023-9-18 閱讀(87)
PCR反應開始前，你需要準備好DNA模板（基因組DNA或者反轉錄制備的cDNA）,特異性的引物（手動設計或利用軟件設計）并選擇合適的商業化DNA聚合酶（根據實驗的目的不同做出決定）。PCR反應開始前的準備工作如下詳解:
1. DNA聚合酶的選擇。市面上有多種DNA聚合酶可供選擇，他們的特性也各有不同。因此你需要選擇自己實驗需要的產品。通常我們將DNA聚合酶分為高保真性聚合酶和普通的Taq聚合酶。如果你希望得到沒有任何突變的PCR產物，那應當選擇高保真聚合酶。若你只是希望判斷特異性序列的存在與否，那普通的Taq聚合酶已經足夠。另外要注意的一點是，進行T載體連接的時候，要了解高保真的聚合酶所得的產物是沒有A末端的，因此你在T載體連接之前需要進行加A反應。或者直接選用普通的Taq聚合酶。
2. 引物。引物特異性會影響到PCR反應成功的可能性，好的引物設計對PCR成功至關重要。設計引物時，有以下幾條原則需要謹慎考慮：
1. 引物長度。通常PCR引物長度在18-22個堿基之間。這對引物的特異性以及退火溫度而言均已足夠。
2. 解鏈溫度Tm。Tm值的定義是使得一半雙鏈DNA解螺旋成為單鏈DNA的溫度。引物的Tm值通常要在52-58度之間。
3. GC含量。GC含量為40-60%。
就目前而言很多軟件都可以用來設計引物，如primer5和Oligo。通常這些軟件設計得到的引物均可以滿足需要。
操作步驟：
準備好各種試劑和PCR儀，就可以開始PCR實驗：將各種試劑混合并按照說明書設置PCR反應。一般PCR循環如下：
1. 起始步驟：這對于熱啟動PCR而言是必須的，將反應混合液加熱至94-98度以激活DNA聚合酶。這一步的時間取決于所選用的DNA聚合酶。
2. 變性步驟：DNA本身是雙鏈結構，而DNA擴增需要引物與單鏈DNA模板相結合。在這一步，反應混合液被加熱至94-98度保持20-30秒以破壞雙鏈間的氫鍵以便釋放出單鏈DNA。這是PCR循環中的第一步。
3. 退火步驟：變性之后，DNA模板以單鏈的形式在反應混合液中存在。因為反應體系中的引物與DNA模板互補，當反應溫度降至50-65度時，引物與互補的序列形成氫鍵。退火溫度主要取決于引物的Tm值，通常比引物Tm值低3-5度。這一步通常維持20-40秒，而聚合酶會結合至引物-模板雙鏈處開始DNA合成。
4. 延伸步驟：在這一步，DNA聚合酶開始DNA合成，因此這一步的溫度選取的是DNA聚合酶的 優溫度。通常我們選用72度，但某些DNA聚合酶的最適溫度是68度。這一步與體內的DNA復制很相似：DNA聚合酶按照堿基互補規律將dNTPs加到引物的3’末端最終得到新的DNA雙鏈片段。延伸時間取決于目的DNA片段的長度和DNA聚合酶的合成能力。一般而言DNA聚合酶每60秒能夠合成1kb長度的DNA。
5. 第2步至第4步稱為一個循環：每次循環之后DNA的量均是前一次的兩倍。通常一次PCR反應進行30-35個循環。在前幾輪的PCR循環過程中PCR產物的量以指數速率增長，但是到了反應后期隨著dNTPs和引物的量的減少以及DNA聚合酶的失活，反應速率逐漸下降，因此PCR反應的產量也受到了限制。
6. 最后的延伸步驟：當30-35個循環結束后，我們通常會以68-74度延伸5-10分鐘，這是希望使反應體系中殘留的單鏈DNA全部反應完畢。
7. 維持時間：通常我們設置4-10度為反應后PCR產物的保存溫度。
