小鼠顆粒酶A（Gzms-A；GZMA）酶聯免疫分析(ELISA)
試劑盒使用說明書
本試劑僅供研究使用 目的：本試劑盒用于測定小鼠血清、血漿、組織勻漿及相關液體樣本中顆粒酶A（Gzms-A；GZMA）的含量。
實驗原理：
本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中小鼠顆粒酶A（Gzms-A；GZMA）水平。用純化的小鼠顆粒酶A（Gzms-A；GZMA）捕獲抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被的微孔中依次加入小鼠顆粒酶A（Gzms-A；GZMA），再與HRP標記的檢測抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的小鼠顆粒酶A（Gzms-A；GZMA）呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中小鼠顆粒酶A（Gzms-A；GZMA）含量。
試劑盒組成：
試劑盒組成 | 48孔配置 | 96孔配置 | 保存 |
說明書 | 1份 | 1份 | |
封板膜 | 2片 | 2片 | |
密封袋 | 1個 | 1個 | |
酶標包被板 | 1×48 | 1×96 | 2-8℃保存 |
標準品 | 0.3ml×6管 | 0.3ml×6管 | 2-8℃保存 |
酶標試劑 | 5 ml×1瓶 | 10 ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
樣品稀釋液 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
顯色劑A液 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
顯色劑B液 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
終止液 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
20×濃縮洗滌液 | 15ml×1瓶 | 25ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
注：標準品濃度依次為：120、60、30、15、7.5、0 pg/mL.
樣本處理及要求：
1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如出現沉淀，應再次離心。
2. 血漿：應根據標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應該再次離心。
3. 尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。
4. 細胞培養上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。檢測細胞內的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。
5. 組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存備用。標本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。
6. 標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融.
7. 不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
操作步驟
1. 標準品的加樣：設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；。
2. 加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品zui終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
3. 加酶：每孔加入酶標試劑100μl，空白孔除外。
4. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育60分鐘。
5. 配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。
6. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。
7. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.
8. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。
9. 測定：以空白孔調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止液后15分鐘以內進行。
注意事項：
1． 試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。
2． 濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。
3． 各步加樣均應使用加樣器，并經常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間控制在5分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。
4． 請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。如標本中待測物質含量過高（樣本OD值大于標準品孔*孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數（n倍）后再測定，計算時請zui后乘以總稀釋倍數（×n×5）。
5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6． 底物請避光保存。
7． 嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準.
8． 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。
9． 本試劑不同批號組分不得混用。
10. 如與英文說明書有異，以英文說明書為準。
計算：
以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，
在坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD
值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋
倍數；或用標準物的濃度與OD值計算出標
準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值
代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋
倍數，即為樣品的實際濃度。
（此圖僅供參考）
試劑盒性能：
1.樣品線性回歸與預期濃度相關系數R值為0.95以上。
2.批內變異系數與批間變異系數應分別小于10%和15% 。
檢測范圍：
3.75 pg/mL - 120 pg/mL
靈敏度：
zui低檢測濃度小于0.1 pg/mL
保存條件及有效期：
1.試劑盒保存： 2-8℃。
2．有效期： 6個月
基質效應
基質是指樣品中目標分析物以外的部分，由于基質成分會對分析過程有顯著干擾，影響分析結果的準確性。業內把這些影響統稱為基質效應（Matrix Effects）。這是免疫檢測方法開發和使用中需要避開的大坑。
Jennifer Rufer事件就是一個典型的基質效應造成假陽性的案例。該hCG試劑盒用的抗體是鼠源的，業界觀點認為部分人群血液含有抗鼠抗體（HAMA），它們對鼠源的捕獲抗體和檢測抗體都有高親和力，會造成基質效應，導致了假陽性。
如何評估基質效應
基質效應的原因錯綜復雜，但不用擔心，有兩種簡單的方法可以用來評估基質效應。
1. 線性稀釋：
一般來講，抗原和捕獲/檢測抗體之間的結合作用很強，樣品濃度被稀釋并不影響它們的結合，而造成基質效應的非特異結合的力要弱很多，如果不斷稀釋樣品，非特異結合造成的干擾會逐步減少，測量值也更接近真實值。沒有基質效應時，無論如何稀釋，測量值都和真實值吻合。而有基質效應時，稀釋會造成非特異性結合比例的減少，測量值也相應地產生很大改變：
基質效應與線性稀釋關系原理
前文提到，基質效應導致的結果有假陰性和假陽性兩種，在線性稀釋時就可以辨別出來。下圖是兩組實測的ELISA產品線性稀釋的對比結果，不同品牌的ELISA 試劑盒表現差距非常大：
兩種類型的基質效應的線性稀釋結果比較（左圖為兩種BDCA-3試劑盒，右圖為兩種TFPI試劑盒）
圖中的縱坐標代表的是回收率。定義用原液直接檢測的值為100%，不同稀釋比下的測量值先乘上稀釋比換算出濃度，再除以原液直接檢測的值，比值的百分數，就是回收率。
左圖的黃色線，和右圖的紅色線，曲線平直，回收率穩定在90-110%，很好地控制了基質效應的干擾。左圖的紫色線，回收率隨線性稀釋嚴重偏離100%，說明存在顯著的基質效應；而回收率升高的趨勢，說明稀釋前的真實濃度被壓低，對應基質效應是假陰性。右圖的綠色線也嚴重偏離100%，但回收率隨稀釋降低，于左圖紫色線正好相反，屬于明顯的假陽性基質效應。
2. 摻入/回收率實驗（Spike/Recovery Assay）
基質效應還可以通過分析物的摻入/回收率實驗發現，將低、中和高濃度的分析物摻入到已測定過濃度的樣本中，摻入前后實測到的濃度增加部分與摻入濃度之比就是回收率，回收率以百分比的形式呈現。回收率介于80-120%，才符合標準。
基質效應
基質是指樣品中目標分析物以外的部分，由于基質成分會對分析過程有顯著干擾，影響分析結果的準確性。業內把這些影響統稱為基質效應（Matrix Effects）。這是免疫檢測方法開發和使用中需要避開的大坑。
Jennifer Rufer事件就是一個典型的基質效應造成假陽性的案例。該hCG試劑盒用的抗體是鼠源的，業界觀點認為部分人群血液含有抗鼠抗體（HAMA），它們對鼠源的捕獲抗體和檢測抗體都有高親和力，會造成基質效應，導致了假陽性。
如何評估基質效應
基質效應的原因錯綜復雜，但不用擔心，有兩種簡單的方法可以用來評估基質效應。
1. 線性稀釋：
一般來講，抗原和捕獲/檢測抗體之間的結合作用很強，樣品濃度被稀釋并不影響它們的結合，而造成基質效應的非特異結合的力要弱很多，如果不斷稀釋樣品，非特異結合造成的干擾會逐步減少，測量值也更接近真實值。沒有基質效應時，無論如何稀釋，測量值都和真實值吻合。而有基質效應時，稀釋會造成非特異性結合比例的減少，測量值也相應地產生很大改變：
基質效應與線性稀釋關系原理
前文提到，基質效應導致的結果有假陰性和假陽性兩種，在線性稀釋時就可以辨別出來。下圖是兩組實測的ELISA產品線性稀釋的對比結果，不同品牌的ELISA 試劑盒表現差距非常大：
兩種類型的基質效應的線性稀釋結果比較（左圖為兩種BDCA-3試劑盒，右圖為兩種TFPI試劑盒）
圖中的縱坐標代表的是回收率。定義用原液直接檢測的值為100%，不同稀釋比下的測量值先乘上稀釋比換算出濃度，再除以原液直接檢測的值，比值的百分數，就是回收率。
左圖的黃色線，和右圖的紅色線，曲線平直，回收率穩定在90-110%，很好地控制了基質效應的干擾。左圖的紫色線，回收率隨線性稀釋嚴重偏離100%，說明存在顯著的基質效應；而回收率升高的趨勢，說明稀釋前的真實濃度被壓低，對應基質效應是假陰性。右圖的綠色線也嚴重偏離100%，但回收率隨稀釋降低，于左圖紫色線正好相反，屬于明顯的假陽性基質效應。
2. 摻入/回收率實驗（Spike/Recovery Assay）
基質效應還可以通過分析物的摻入/回收率實驗發現，將低、中和高濃度的分析物摻入到已測定過濃度的樣本中，摻入前后實測到的濃度增加部分與摻入濃度之比就是回收率，回收率以百分比的形式呈現。回收率介于80-120%，才符合標準。
基質效應
基質是指樣品中目標分析物以外的部分，由于基質成分會對分析過程有顯著干擾，影響分析結果的準確性。業內把這些影響統稱為基質效應（Matrix Effects）。這是免疫檢測方法開發和使用中需要避開的大坑。
Jennifer Rufer事件就是一個典型的基質效應造成假陽性的案例。該hCG試劑盒用的抗體是鼠源的，業界觀點認為部分人群血液含有抗鼠抗體（HAMA），它們對鼠源的捕獲抗體和檢測抗體都有高親和力，會造成基質效應，導致了假陽性。
如何評估基質效應
基質效應的原因錯綜復雜，但不用擔心，有兩種簡單的方法可以用來評估基質效應。
1. 線性稀釋：
一般來講，抗原和捕獲/檢測抗體之間的結合作用很強，樣品濃度被稀釋并不影響它們的結合，而造成基質效應的非特異結合的力要弱很多，如果不斷稀釋樣品，非特異結合造成的干擾會逐步減少，測量值也更接近真實值。沒有基質效應時，無論如何稀釋，測量值都和真實值吻合。而有基質效應時，稀釋會造成非特異性結合比例的減少，測量值也相應地產生很大改變：
基質效應與線性稀釋關系原理
前文提到，基質效應導致的結果有假陰性和假陽性兩種，在線性稀釋時就可以辨別出來。下圖是兩組實測的ELISA產品線性稀釋的對比結果，不同品牌的ELISA 試劑盒表現差距非常大：
兩種類型的基質效應的線性稀釋結果比較（左圖為兩種BDCA-3試劑盒，右圖為兩種TFPI試劑盒）
圖中的縱坐標代表的是回收率。定義用原液直接檢測的值為100%，不同稀釋比下的測量值先乘上稀釋比換算出濃度，再除以原液直接檢測的值，比值的百分數，就是回收率。
左圖的黃色線，和右圖的紅色線，曲線平直，回收率穩定在90-110%，很好地控制了基質效應的干擾。左圖的紫色線，回收率隨線性稀釋嚴重偏離100%，說明存在顯著的基質效應；而回收率升高的趨勢，說明稀釋前的真實濃度被壓低，對應基質效應是假陰性。右圖的綠色線也嚴重偏離100%，但回收率隨稀釋降低，于左圖紫色線正好相反，屬于明顯的假陽性基質效應。
2. 摻入/回收率實驗（Spike/Recovery Assay）
基質效應還可以通過分析物的摻入/回收率實驗發現，將低、中和高濃度的分析物摻入到已測定過濃度的樣本中，摻入前后實測到的濃度增加部分與摻入濃度之比就是回收率，回收率以百分比的形式呈現。回收率介于80-120%，才符合標準。
基質效應
基質是指樣品中目標分析物以外的部分，由于基質成分會對分析過程有顯著干擾，影響分析結果的準確性。業內把這些影響統稱為基質效應（Matrix Effects）。這是免疫檢測方法開發和使用中需要避開的大坑。
Jennifer Rufer事件就是一個典型的基質效應造成假陽性的案例。該hCG試劑盒用的抗體是鼠源的，業界觀點認為部分人群血液含有抗鼠抗體（HAMA），它們對鼠源的捕獲抗體和檢測抗體都有高親和力，會造成基質效應，導致了假陽性。
如何評估基質效應
基質效應的原因錯綜復雜，但不用擔心，有兩種簡單的方法可以用來評估基質效應。
1. 線性稀釋：
一般來講，抗原和捕獲/檢測抗體之間的結合作用很強，樣品濃度被稀釋并不影響它們的結合，而造成基質效應的非特異結合的力要弱很多，如果不斷稀釋樣品，非特異結合造成的干擾會逐步減少，測量值也更接近真實值。沒有基質效應時，無論如何稀釋，測量值都和真實值吻合。而有基質效應時，稀釋會造成非特異性結合比例的減少，測量值也相應地產生很大改變：
基質效應與線性稀釋關系原理
前文提到，基質效應導致的結果有假陰性和假陽性兩種，在線性稀釋時就可以辨別出來。下圖是兩組實測的ELISA產品線性稀釋的對比結果，不同品牌的ELISA 試劑盒表現差距非常大：
兩種類型的基質效應的線性稀釋結果比較（左圖為兩種BDCA-3試劑盒，右圖為兩種TFPI試劑盒）
圖中的縱坐標代表的是回收率。定義用原液直接檢測的值為100%，不同稀釋比下的測量值先乘上稀釋比換算出濃度，再除以原液直接檢測的值，比值的百分數，就是回收率。
左圖的黃色線，和右圖的紅色線，曲線平直，回收率穩定在90-110%，很好地控制了基質效應的干擾。左圖的紫色線，回收率隨線性稀釋嚴重偏離100%，說明存在顯著的基質效應；而回收率升高的趨勢，說明稀釋前的真實濃度被壓低，對應基質效應是假陰性。右圖的綠色線也嚴重偏離100%，但回收率隨稀釋降低，于左圖紫色線正好相反，屬于明顯的假陽性基質效應。
2. 摻入/回收率實驗（Spike/Recovery Assay）
基質效應還可以通過分析物的摻入/回收率實驗發現，將低、中和高濃度的分析物摻入到已測定過濃度的樣本中，摻入前后實測到的濃度增加部分與摻入濃度之比就是回收率，回收率以百分比的形式呈現。回收率介于80-120%，才符合標準。
基質效應
基質是指樣品中目標分析物以外的部分，由于基質成分會對分析過程有顯著干擾，影響分析結果的準確性。業內把這些影響統稱為基質效應（Matrix Effects）。這是免疫檢測方法開發和使用中需要避開的大坑。
Jennifer Rufer事件就是一個典型的基質效應造成假陽性的案例。該hCG試劑盒用的抗體是鼠源的，業界觀點認為部分人群血液含有抗鼠抗體（HAMA），它們對鼠源的捕獲抗體和檢測抗體都有高親和力，會造成基質效應，導致了假陽性。
如何評估基質效應
基質效應的原因錯綜復雜，但不用擔心，有兩種簡單的方法可以用來評估基質效應。
1. 線性稀釋：
一般來講，抗原和捕獲/檢測抗體之間的結合作用很強，樣品濃度被稀釋并不影響它們的結合，而造成基質效應的非特異結合的力要弱很多，如果不斷稀釋樣品，非特異結合造成的干擾會逐步減少，測量值也更接近真實值。沒有基質效應時，無論如何稀釋，測量值都和真實值吻合。而有基質效應時，稀釋會造成非特異性結合比例的減少，測量值也相應地產生很大改變：
基質效應與線性稀釋關系原理
前文提到，基質效應導致的結果有假陰性和假陽性兩種，在線性稀釋時就可以辨別出來。下圖是兩組實測的ELISA產品線性稀釋的對比結果，不同品牌的ELISA 試劑盒表現差距非常大：
兩種類型的基質效應的線性稀釋結果比較（左圖為兩種BDCA-3試劑盒，右圖為兩種TFPI試劑盒）
圖中的縱坐標代表的是回收率。定義用原液直接檢測的值為100%，不同稀釋比下的測量值先乘上稀釋比換算出濃度，再除以原液直接檢測的值，比值的百分數，就是回收率。
左圖的黃色線，和右圖的紅色線，曲線平直，回收率穩定在90-110%，很好地控制了基質效應的干擾。左圖的紫色線，回收率隨線性稀釋嚴重偏離100%，說明存在顯著的基質效應；而回收率升高的趨勢，說明稀釋前的真實濃度被壓低，對應基質效應是假陰性。右圖的綠色線也嚴重偏離100%，但回收率隨稀釋降低，于左圖紫色線正好相反，屬于明顯的假陽性基質效應。
2. 摻入/回收率實驗（Spike/Recovery Assay）
基質效應還可以通過分析物的摻入/回收率實驗發現，將低、中和高濃度的分析物摻入到已測定過濃度的樣本中，摻入前后實測到的濃度增加部分與摻入濃度之比就是回收率，回收率以百分比的形式呈現。回收率介于80-120%，才符合標準。
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