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上海威正翔禹生物科技有限公司
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閱讀：818發布時間：2017-10-19
當我們在養細胞的時候，有可能會出現如下的狀況：
如果排除了其他試劑選擇不當、細胞株老化、細菌污染……原因，而仍有上述一種或幾種情況，則高度提示：細胞可能出現了支原體污染。
據報道，細胞培養中發生支原體污染的機率較高，會達到70%左右，常規抗生素的使用對支原體幾乎無效。
那么，支原體污染，對細胞培養有什么危害呢？
支原體污染的危害
1. 細胞狀態不佳，生長速度慢，實驗無法推進
2. 細胞內DNA、RNA及蛋白表達發生改變，影響實驗結果，導致實驗數據不準確，時間、經費的浪費
3. 一株污染的細胞成為實驗室的污染源，對工作區域以及培養箱和液氮罐造成污染，進而污染其他細胞，導致其他細胞繼發性污染，實驗受影響，數據無法重復，預期結果出不來
圖：支原體給細胞帶來的諸多影響
圖：一管細胞的污染可影響到其他細胞
那么，怎樣明確細胞是否有支原體污染呢？
目前普遍使用的支原體檢測方法
1、支原體的分離培養
它是支原體污染鑒定的金標準，準確，價格便宜。但支原體在分離培養的過程中，要長出明顯克隆至少需要4周時間，所需時間較長。
2、ELISA方法
檢測步驟復雜，出現誤差的幾率較高，對實驗者操作技巧有要求。同時試劑盒成本較高，普遍不被選用。
3、DNA熒光染色法
它采用熒光染色劑Hoechst 33258和支原體DNA富含A-T的區域結合。價格適中。由于DNA檢測需要將可疑樣品與指示細胞共同培養，因此一般需要幾天后才出結果。有假陽性和假陰性，需要與其他方法結合使用。
4、PCR技術
它根據支原體核糖體16s-23s rRNA的特異保守序列設計引物，對待檢樣本DNA進行擴增，通過對擴增產物的大小分析作出診斷（見下圖）。操作簡單、速度快，只需2-3小時即可出結果，通量高，價格適中。
但是，不同廠家生產的PCR檢測試劑盒由于引物及內在設計的不同，其準確度和敏感度有天壤之別。
目前，被各大實驗室及生物藥廠普遍選用的是德國Minerva Biolabs公司開發生產的支原體PCR檢測試劑盒。試劑盒在267bp的條帶，涵蓋了歐洲《藥典》中zui易感染細胞的26種支原體亞型，保證了其*的敏感度；通過內控條帶的設計，防止了假陰性的發生。
我國*在2008年豬藍耳病疫苗研制的重點項目中，實驗者用此檢測法與培養法做了超過100次的平行比對實驗，結果全部一致，假陽性率和假陰性率為零。
因此，用PCR方法檢測支原體，其準確性與選擇的試劑盒的質量有直接相關性。
圖：有支原體污染的樣本在267bp位置有陽性條帶。Internal Control為內部對照，在190bp，保證PCR反應的正常。
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