靶向標(biāo)志物GPC3（Glypican3）熒光納米探針合成路線

GPC3是在研究過度生長綜合癥（Simpson-Golabi-Behmel syndrome，SGBS）時發(fā)現(xiàn)的蛋白聚糖家族成員。GPC3基因位于人X染色體上（Xq26.1）。它的啟動子區(qū)包括6個SPI結(jié)構(gòu)、7個AP2結(jié)構(gòu)和2個CAAT盒，產(chǎn)生2 130 bp的轉(zhuǎn)錄子，編碼含580個氨基酸殘基的GPC3蛋白質(zhì)前體。GPC3核心蛋白相對分子質(zhì)量約為70 ku，它富含一段包括14個半胱氨酸殘基的*序列，中間為furin蛋白酶切位點。Furin蛋白酶裂解Arg358和Cys359形成40 ku的N末端亞基和30 ku的C末端亞基。在N末端有一種分泌型信號蛋白，C末端通過與糖基磷脂酰肌醇共價結(jié)合而錨定于細胞膜上，且硫酸乙酰肝素鏈插入點的位置均由C端zui末50個氨基酸所決定，使該鏈靠近細胞膜。

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       越來越多的研究表明GPC3可用于HCC常規(guī)組織檢查和潛在治療靶點，靶向腫瘤標(biāo)志物GPC-3的熒光納米探針的制備方法，包括如下步驟：

（1）制備以ZnS為殼層的核殼結(jié)構(gòu)量子點；

（2）取2~10ml的以ZnS為殼層的核殼結(jié)構(gòu)量子點溶液超生分散，15000rpm轉(zhuǎn)離心30~50min，加超純水0.5ml，備用；

（3）取5~20mg的碳化二亞胺（EDC），1~10mgN-羥基硫代琥珀酰亞胺（NHSS）加水1.0ml溶解；

（4）取上述溶液0.3~1.0ml加入以ZnS為殼層的核殼結(jié)構(gòu)量子點溶液中，定容至1.0~5.0ml，37℃搖床反應(yīng)1~2小時；

（5）15000rpm高速離心30~50分鐘，棄上清，用pH8.5的PBS溶液250~1000μl重新溶解；

（6）加5~20μl的靶向GPC-3的單抗GC-33溶液，37℃的恒溫下，搖床反應(yīng)2~3小時，將單抗GC-33修飾到以ZnS為殼層的核殼結(jié)構(gòu)量子點的表面；

（7）15000rpm離心30~50分鐘，溶于pH7.2的PBS溶液中，分離提純得到靶向腫瘤標(biāo)志物GPC-3的熒光納米探針（GC-QDs）。

    其中，所述步驟（1）中的以ZnS為殼層的核殼結(jié)構(gòu)量子點為ZnO/ZnS。

本發(fā)明的上述技術(shù)方案的有益效果如下：

1.本發(fā)明中核殼結(jié)構(gòu)的量子點載體的合成方法避免使用三辛基膦（TOP）或磷酸三丁酯（TBP）等危險試劑，安全、環(huán)保，并且步驟簡單，成本低廉。

2.本發(fā)明通過改進合成方法和核殼的結(jié)構(gòu)比率等，可制備一系列不同粒徑和結(jié)構(gòu)比例的核殼結(jié)構(gòu)的量子點，實現(xiàn)量子點在可見-近紅外區(qū)內(nèi)實現(xiàn)熒光可調(diào)，具有更好的熒光發(fā)光性質(zhì)，并且通過ZnS的殼層修飾降低或者消除了內(nèi)核量子點的生物毒性，使其具有更好的生物安全性。

3.本發(fā)明通過將GC-33修飾到量子點的表面制備得到高特異性、高靶向性的納米探針，通過克服生物組織對熒光干擾的影響，實現(xiàn)對肝癌的原位、活體標(biāo)記與成像，為熒光量子點的臨床應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)和理論研究。

4.按照本發(fā)明提供的技術(shù)方案所制備的GC-QDs納米探針，還可作為載體在制備靶向納米復(fù)合藥物中應(yīng)用。