腫瘤細(xì)胞的軟瓊脂集落培養(yǎng)和測定
一、原理
在體外培養(yǎng)基中由一個祖先細(xì)胞增殖形成的細(xì)胞團，稱之為集落。腫瘤細(xì)胞能無限繁殖，所以具有這種能力，而成熟分化的細(xì)胞則不能形成集落。HL一60細(xì)胞是一種急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞，在體外無需加刺激因子，可在軟瓊脂培養(yǎng)基中形成集落。二甲基亞砜是一種細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑，經(jīng)二甲基亞砜處理后的HL一60細(xì)胞按粒系途徑定向成熟分化，同時細(xì)胞的增殖力降低，幾乎全部細(xì)胞喪失了軟瓊脂中形成集落的能力。因此，這種方法可用于細(xì)胞分化的基礎(chǔ)研究和臨床*的療效檢驗等方面。
二、操作
1．收集對數(shù)生長期的HL一60細(xì)胞，先按實驗十三測定細(xì)胞活力，然后調(diào)整細(xì)胞濃度，制成300～1000活細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液。
2．取二個培養(yǎng)瓶每個瓶中加9ml調(diào)整好濃度的細(xì)胞懸液，然后各加入1ml 3％瓊脂(已融化，在65℃水浴中放置)，迅速加入，混勻。
3．用微量加樣器吸140μl二甲基亞砜(MDSO)，加到一個瓶中，充分混勻，為實驗組，另一瓶不加DMSO，為空白對照組。
4．取一個16mm多孔培養(yǎng)板，每孔加1ml(35mm培養(yǎng)皿需加2ml)細(xì)胞瓊脂懸液，勿有氣泡，將實驗組和對照組分兩組加好，蓋上蓋并作好標(biāo)記。
5．在室溫放置20分鐘使細(xì)胞瓊脂懸液凝固。
以上各步驟均在無菌條件下進(jìn)行。
6．然后移培養(yǎng)板或平皿于CO2培養(yǎng)箱中37℃進(jìn)行培養(yǎng)。
7．培養(yǎng)7～10天，肉眼觀察并計數(shù)細(xì)胞集落。
三、結(jié)果
以肉眼可見的細(xì)胞團(含500個以上細(xì)胞)作為計數(shù)集落的標(biāo)準(zhǔn)。對照組HL一60細(xì)胞在含0.3％的軟瓊脂培養(yǎng)基中生長良好，每個孔中可見有多個集落形成，而實驗組HL一60細(xì)胞因經(jīng)二甲基亞砜誘導(dǎo)分化，細(xì)胞在軟瓊脂中的集落形成明顯減少。
四、集落的計數(shù)和計算
集落數(shù)=n孔中細(xì)胞集落數(shù)總和/n孔
集落形成率=集落數(shù)/接種培養(yǎng)細(xì)胞總數(shù)×100％
