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閱讀：2641發(fā)布時(shí)間：2017-4-20
活化的caspase 3的檢測(cè)
半*天冬氨酸蛋白酶) 是近年發(fā)現(xiàn)的一組存在于細(xì)胞質(zhì)中，活化位點(diǎn)均含有半*，且特異性斷開(kāi)天冬氨酸殘基后肽鍵的蛋白酶。Caspase在細(xì)胞程序性死亡（又稱凋亡，apoptosis）中起重要作用。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的人的caspase家族成員已達(dá)12種。
Caspase 3 是caspase家族的一個(gè)重要成員，其在細(xì)胞凋亡過(guò)程中作為zui主要的終末剪切酶行使作用。該蛋白由pro-caspase 3 酶原經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的加工而形成，pro-caspase 3 是一個(gè)含有277個(gè)氨基酸殘基的前體蛋白，對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，可以分為以下四個(gè)部分：*部分是含有第1-9aa的前肽，第二部分是含有第10-28aa的前肽，第三部分是包含29-17a的大亞基，稱為p17，第四部分是包含176-277aa的小亞基，稱為p12 (圖1)。在凋亡開(kāi)始時(shí)，pro-caspase3酶原可以被內(nèi)源性的顆粒酶B和外源性的*等因素激活，使其在Asp28~Ser29和Asp175~Ser176兩處被剪切，形成p17和p12兩個(gè)亞基。此后，兩種亞基再組成具有活性的caspase 3，活化的caspase 3是含有2個(gè)p17亞基和2個(gè)p12亞基的異源四聚體，它可以通過(guò)對(duì)其主要的底物：多聚 (二磷酸腺苷-核糖)聚合酶 (poly (ADP-ribose)polymerase, PARP) 等進(jìn)行剪切而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的進(jìn)行。
由于Caspase 3在凋亡過(guò)程中行使重要作用，并且其需要以活化的形式發(fā)揮功能，所以，對(duì)活化的caspase 3以及其活性的檢測(cè)就十分重要，公司針對(duì)Caspase 3的兩個(gè)亞基分別進(jìn)行了序列分析、基因克隆和蛋白表達(dá)，獲得
了Caspase 3的兩個(gè)亞基的蛋白，其貨號(hào)分別為：和。在細(xì)胞凋亡的研究過(guò)程中，研究者可以同時(shí)使用p17 這兩種亞基蛋白，使其在試驗(yàn)體系中組裝成為活化的Caspase 3，并發(fā)揮其在細(xì)胞調(diào)亡過(guò)程中的作用。
用這兩種蛋白作為免疫原分別免疫小鼠和兔后，獲得了單克隆抗體和多克隆抗體 。這些抗體可用于對(duì)pro-caspase 3的活化程度的定量或半定量檢測(cè)。圖2是一組通過(guò)Western blot對(duì)pro-caspase 3和p17／p12亞基含量的對(duì)比分析來(lái)確定Caspase3在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中活化的進(jìn)程和速度的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
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