深圳子科生物報道：

CRISPR/Cas9 系統作為新一代基因組編輯技術，為生命科學的研究提供了革命性的工具，為生物技術在醫藥、農業、工業領域的應用迎來了新機遇。但是在很多真核生物中，由于缺乏向導 RNA 表達方法，CRISPR/Cas9 系統的建立和應用受到很大制約。黑曲霉是一種重要的工業微生物，其產品檸檬酸、酶制劑等在食品、醫藥、化工等領域用途廣泛，然而目前仍然無法實現對黑曲霉的基因組編輯，限制了其工程應用潛力的發揮。

近日，中國科學院天津工業生物技術研究所研究員孫際賓帶領的系統生物學中心與研究員鄭平帶領的系統與合成生物技術研究團隊合作，在重要工業微生物黑曲霉中提出以核糖體 5S rRNA 基因為啟動子介導 sgRNA 的表達，開發了一種基于 5S rRNA 的新型的 CRISPR/Cas9 系統，使 Cas9 對黑曲霉基因組定點切割效率可達 100%。以此建立了黑曲霉基因組編輯工具包，以 40 bp 的短同源臂供體 DNA 可以簡便地實現單位點、多位點的基因敲入以及長至 48 kb 的大片段 DNA 敲除等基因組編輯。該新型 CRISPR/Cas9 系統有效解決了黑曲霉 sgRNA 的活性表達問題，突破了黑曲霉基因組編輯的瓶頸，為認識黑曲霉工業潛力的生物學分子基礎，進一步提升其工業應用性能，開發新型細胞工廠和新產品提供了強有力的技術支撐。同時，由于核糖體 5S rRNA 的高度保守性，在任意生物中都可以快速找到其 5S rRNA 基因，基于 5S rRNA 的向導 RNA 表達策略的提出，為解決真核生物向導 RNA 表達難題、實現 CRISPR/Cas9 基因組編輯系統在各種真核生物的建立和應用開辟了普適性的新思路。

該研究得到國家自然科學基金青年與面上項目以及中科院人才計劃等項目的支持，相關研究成果已發表在期刊 ACS Synthetic Biology 上。天津工生所助理研究員鄭小梅為論文的*作者。

圖 1 應用不同的 guide RNA 表達策略的 CRISPR/Cas9 系統介導黑曲霉 albA 基因失活。（A）CRISPR/Cas9 系統介導的 albA 基因失活的基因組編輯過程示意圖；（B）5S rRNA 基因啟動 guide RNA 表達的核心序列鑒定；（C）不同啟動子策略對 albA 基因失活效率的影響。

圖 2 基于 5S rRNA 的 CRISPR/Cas9 系統介導的黑曲霉基因組編輯效率

圖 3 基于 5S rRNA 的 CRISPR/Cas9 系統實現黑曲霉基因組編輯的實驗流程示例