蛋白純化試劑盒主要是利用蛋白與親和介質的親和能力不同達到蛋白分離純化的目的。蛋白純化試劑常見的蛋白標簽有GST標簽、HIS 標簽等，本文主要介紹了蛋白純化試劑盒的原理、His Tag 蛋白純化方法試劑選擇的方法、GST 標簽融合蛋白純化問題分析等。

蛋白抽提試劑盒和蛋白純化試劑盒用途有什么不同?

蛋白抽提試劑盒是從細菌 、真菌、新鮮動植物組織或細胞蛋白、培養動植物組織將全細胞蛋白、核蛋白、胞漿蛋白、化學修飾基團的天然蛋白(例如磷酸化蛋白)中的一種或兩種以上作為目標從樣品中分離收集的一套試劑。用于液體樣品中蛋白濃縮、提取、或脫鹽、脫去垢劑、脫還原劑等目的。

蛋白純化試劑盒用于將連接有Flag標簽 GST HIS 標簽的重組蛋白、包涵體蛋白、抗體從重組蛋白表達系統中濃縮分離出來。主要原理是利用蛋白A或蛋白G與抗體的不變區有多個結合位點或Ni-Sepharose與HIS標簽蛋白在不同緩沖液條件下親和能力多得多差異分離目標蛋白。將蛋白A與Sepharose共價交聯制備的層析介質，可以用于純化抗體。抗體與蛋白A或蛋白G在高鹽高pH值條件下結合，在低鹽低pH值條件下解離。蛋白純化試劑盒廣泛的應用于蛋白表達、純化、鑒定、功能研究及其蛋白相互作用等相關領域。

GST常見問題解答集錦純化方法的問題解決

以下解決問題的指南指出了對于大多數純化方法的普遍問題,對于特別的純化方法的問題也有 提及,這種情況下會指出相應的純化方法.

GST標簽蛋白被機械裂解的方法                                                         在裂解過程中,用溫和的機械/化學裂解條件.                                               裂解的條件 不結合柱子或 變性(比如超聲).過分的裂解必須依照經驗來決定. 結合非常弱會使標簽蛋白變性,阻止其結合. GST標簽蛋白在樣品中有聚集,在細胞裂解前加入DTT,在緩沖液中也加入DTT.1-20mM 導致沉淀 標簽蛋白的濃度過低的DTT會顯著增加某些GST蛋白的結合. 濃縮樣品.結合能力是濃度依賴的.低表達量的蛋白可能 不會像高表達量蛋白那樣有效地結合柱子.因此,濃縮樣 品會提高結合. 標 簽 蛋 白 可 能 改 變 了 G S T 的 構 檢測所使用的pGEX載體中GST的結合.準備帶有所使用的 象,因此降低了GST標簽蛋白的 pGEX的細胞超聲裂解物,檢測其與柱材的結合.如果結合 結合能力. 的很好,則可能是標簽蛋白改變了GST的構象,因此降低了 GST標簽蛋白的親和力.可以通過降低結合的溫度到4°C限 制洗滌來改善結果. 平衡時間太短 確認柱材至少用5倍柱體積的pH6.5到8.0的緩沖液平衡過 (比如PBS). GST標簽蛋白在pH值低于6.5和高 在凈化好的樣品上樣前用pH6.5到8.0的緩沖液平衡過(比如 于8時結合效率低 GSTrap柱:柱子需要清洗 PBS). 根據標準的清洗步驟清洗柱子(見附錄2).如果GSTrap柱 已經用過幾次了,可能需要換用新柱. Glutathione Sepharose柱材使用 使用新的Glutathione Sepharose柱材(清洗過程請見附錄 次數過多 樣品上樣過程中的流速過高 2) 降低在上樣時的流速.影響GST標簽蛋白結合的一個重要參 數就是流速.由于GST與谷胱甘肽相對慢的結合,在樣品上 樣過程中保持低流速以獲得zui大結合能力很重要. 在KTAprime plus上的GSTrap 柱子堵住了:根據說明書清潔柱子,確認樣品已經離心或 柱:柱子或系統被堵住了,導致 用0.45m的濾膜過濾過了. 高壓力和無結合. 系統堵住了:將柱子換成一段管子.如果壓力高于 0.3MPa,根據手冊清洗系統 在KTAprime plus上的GSTrap 檢測是否使用了正確的柱子. 柱:樣品不結合 檢測流入管是否接入了正確的流入端口. 檢測緩沖液的組成和pH值是否正確.檢測樣品是否已經被 調節到適合結合緩沖液的條件.

1G S T 標 簽 蛋 白 洗脫緩沖液的體積不夠 不能被的 洗脫 洗脫的時間不夠

增加洗脫緩沖液的體積.有些情況下,尤其是柱上酶切有 標簽蛋白時,需要更大體積的緩沖液來洗脫標簽蛋白. 通過降低洗脫過程中的流速來增加洗脫時間. 對于gstrap柱,為了獲得的結果,在樣品上樣時,用 0.2到1ml/min的流速(1ml HiTrap柱),0.5到5ml/min的流 速(5ml HiTrap柱).對于離心方法,降低洗脫過程中的離 心速度.

谷胱甘肽的濃度不夠

增加洗脫緩沖液中谷胱甘肽的濃度:本方案中建議的10mM 濃度對于大多數應用來說足夠了,但是也存在例外.嘗試 使用50mM Tris-HCl,20-40mM 還原型谷胱甘肽,pH8.0作 為洗脫緩沖液.

洗脫緩沖液的pH過低

增加洗脫緩沖液的pH值:將pH增加到8-9會增強洗脫而不 用提高洗脫所用谷胱甘肽的濃度.

洗脫緩沖液的離子強度過低.

增加洗脫緩沖液中的離子強度,在洗脫緩沖液中加入0.10.2M的氯化鈉也會使結果變好.

洗脫緩沖也中的谷胱甘肽被氧化 使用新鮮的洗脫緩沖液. 了 加入DTT.

非特異的疏水相互作用導致蛋白 向洗脫緩沖液中加入非離子去垢劑.加入1%的TritonX-100 和柱材非特異的結合或聚集,從 或2%的n-octylglucoside可以顯著提高某些GST標簽蛋白的 而 阻 止 了 標 簽 蛋 白 的 溶 解 和 洗 洗脫. 脫. 電泳或蛋白質 分子量為70 000 的蛋白與GST標 分子量為70 000 的蛋白可能是大腸桿菌dnaK基因的產物. 免疫印跡檢測 簽蛋白共純化 發現多條條帶 該蛋白參與大腸桿菌中蛋白質折疊.有報道這種相互作 用可以通過上樣前在50mM Tris-HCl,2mM ATP,10mM MgSO4,pH7.4中37°C溫浴10分鐘而破壞.或者把有標簽 蛋白通過ATP-agarose或相似的純化介質或進行離子交換層 析來除去. 標簽蛋白被蛋白酶部分降解 加入蛋白酶抑制劑.多條條帶可能是由于目的蛋白被蛋白 酶部分降解的結果.在裂解溶液中加入1mM PMSF可能會 使結果變好.一種無毒的水溶性的PMSF替代物是AEBSF, Roche Biochemicals的商品名為Pefabloc SC.注:絲氨酸 蛋白酶抑制劑必須在使用凝血酶或凝血因子Xa前除去. Prescission Protease不是一種經典的絲氨酸蛋白酶.經GE Healthcare檢測,它對很多蛋白酶抑制劑不敏感. PMSF有毒,有急性作用.如果可能的話使用Pefabloc SC.

2在宿主細菌中的蛋白降解

用一種蛋白酶缺失型宿主:多條帶可能是在宿主細菌中蛋 白酶切造成的.如果是這種情況,或許需要蛋白酶缺陷型 菌株(比如lon-或ompT).大腸桿菌BL21隨pGEX載體提供. 這種菌株是ompT和lon缺陷型菌株.

在機械裂解過程中細胞破碎

降低裂解時間:細胞裂解表面上是使懸濁液部分澄清,可 以通過鏡檢檢測.機械裂解前加入溶菌酶(0.1倍體積的10 毫克/毫升溶菌酶溶液,溶菌酶保存在25mM Tris-HCl,pH8.0 )可能會使結果變好.避免發泡,因為這可能使標簽蛋白 變性.過分裂解也會導致宿主細胞蛋白和GST標簽蛋白共純 化.

分子伴侶可能被共純化了

包括額外的純化步驟:多余的條帶可能由于共純化一些分 子伴侶所造成.這些分子伴侶參與大腸桿菌中新生成的蛋 白的正確折疊.這些包括,但不僅僅是:DnaK(分子量70 000)DnaJ(分子量37 000)GrpE(分子量40 000)GroEL (分子量57 000)GroES(分子量10 000).一些從這些共 純化的蛋白中分離GST標簽蛋白的方法已經發表.

抗體和很多種大腸桿菌中的蛋白 抗體和大腸桿菌蛋白交叉反應:取決于抗GST抗體的來源. 反應 它可能包含一些抗體,這些抗體與標簽蛋白樣品中的大腸 桿菌蛋白能夠反應.通過和大腸桿菌的超聲裂解物反應來 除掉那些能夠交叉反應的抗體.GE Healthcare的GST抗體已 經和大腸桿菌蛋白進行過交叉吸附,并檢測證明其在蛋白 質免疫印跡中沒有非特異條帶. 目的蛋白酶切 蛋白酶切發生在宿主細菌內 后電泳檢測發 現多條條帶 檢測條帶何時出現:確定多余的條帶在Precission Protease,凝血酶,凝血因子Xa切割前不存在.這些條帶可 能是在宿主細菌中降解的結果. 目的蛋白可能含有Precission Protease,凝血酶,凝血因子 Xa的切割位點,檢查序列.細節請參見《GST基因融合系統 手冊》.

His Tag 蛋白純化方法之選擇全攻略

HisTag 蛋白純化篇：用基因工程的方法來表達蛋白質，必須經過純化才 能實現zui終目的。相比核酸純化來說，不同的蛋白質特性千差萬別，純化條件很難摸索，想 找一種通用的純化方法一直是個難題。 將目的蛋白和一個親和純化短標簽進行融合表達， 通 過親和純化 Tag 蛋白來純化目的蛋白，是我們常用的間接手段。 用于融合表達的親和純化蛋白標簽，首先個子越小越好，這樣不會對目標蛋白的構象、大小 和特性產生顯著影響，方便直接對融合蛋白進行下游操作;以前常用的融合表達親和標簽 GST(谷胱甘肽轉移酶)個子就比較大，在純化后需要先切除標簽后才能進行下一步的檢測分 析。其二生理條件下帶電越少越好：需要借助融合表達純化的許多蛋白通常在生理溶液 pH 下進行分析研究或者復性，融合標簽帶電少，對蛋白質的表達、分泌、折疊、構象形成等影 響小，比較容易得到和天然蛋白相似的產物。第三融合標簽的免疫原性越少越好，融合產物 不必除去標簽可直接作為抗原免疫 橫看豎看，6xHis Tag 都是比較理想的，6 個組氨酸個子小，pH8 是不帶電，免疫原性差， 利用的帶鎳離子的純化填料進行親和純化，目標蛋白純度高，方法簡單方便，成本低， 已得到國內外研究人員的廣泛應用。想當年剛進實驗室時,表達 6xHis 的 HisTag 還算“前 衛”技術(表達純化一個帶有 HisTag 的“有重要意義和光輝前景的”蛋白就可以混個碩士 畢業)，如今早成主流了。 我們生物通技術專題早前的表達系統專題中已經介紹過多種帶有 His-Tag 的表達載體， 表達 之后自然需要考慮如何純化，市面上純化 HisTag 的產品多種多樣，應該如何選擇呢?目前 市面上主產品都是利用 His.Tag 序列相鄰組氨酸和固定化金屬鎳離子的親和力來進行純 化。 金屬鎳離子被螯合到固相支持物共價結合的反應性基團上， 當融合蛋白溶液流經親和純 化介質時，融合蛋白被特異親和吸附，雜質被洗掉后再洗脫目標蛋白。zui常用的螯合物包括 氮川乙酸(NTA)和亞氨二乙酸(IDA)，它們分別具有四個和三個與金屬離子相互作用的位 點。生物通在這里介紹幾個市面口碑較好的產品和方法,包括常見的 HisTag 純化品牌： Qiagen，GE，Novagen 等。 Qiagen 產品的 2 大特點是 4 價螯合的 Ni-NTA(nickel-nitrilotriacetic acid);以及種 類齊全。Qiagen 的 4 價螯合的 Ni-NTA 純化填料，由于鎳離子通過 4 價鍵螯合在純化樹 脂(填料)上，比 3 價的 Ni-IDA 要穩固且不容易脫落，且 NTA 與還原二硫鍵的 beta- 巰基乙 醇相容;而存在其它螯合或還原成分時， IDA 樹脂的金屬鎳離子容易脫落可導致純化結果 不甚理想。因此 Ni-NTA 實際應用中的蛋白純化效率和得率較高。因于這種穩固性，Qiagen 的 Ni-NTA 純化介質不單可用于純化帶 HisTag 的表達產物， 還可以作為固定介質用于研究蛋 白質間的相互作用或者蛋白質和核酸間的相互作用、 研究蛋白質受體和配基的相互作用、 甚至用于純化與融合蛋白相互作用的其他蛋白或者核酸。

Qiagen 的 Ni-NTA 純化介質產品種類zui為齊全，設計非常細心體貼，不過花太多，就容易眼 花繚亂，我們說花多眼亂。Qiagen 的目錄里是根據純化實驗的規模分為大、中、小規模， 具體又分為高通量和手工純化等區別， 對于急著尋找自己需要產品的人來說自然便捷; 不過 作為生物通的技術專題文章， 我個人來說更愿意按照介質種類的不同來介紹， 因為理解了材 料的區別，一切都清晰明了，就能更深入了解不同品牌、不同類型、不同產品的特色。 Qiagen 的 Ni-NTA 系列產品可分為 4 類：Ni-NTA 瓊脂糖、Ni-NTA Superflow、Ni-NTA 磁珠、 Ni-NTA 離心柱(Spin Column)。 昔年做銷售時 Ni-NTA 瓊脂糖是zui多人買，因為價格相對便宜，質需要將澄清的裂解液(或 者離心或者過濾)直接上柱，洗脫，就可以一步純化出帶有 His Tag 的融合蛋白。這個目標 蛋白載量 10mg/ml 左右，介質是 Sepharose CL-6B，zui大流速是每分鐘 1 毫升，可耐受的zui 大柱內壓 2.8psi(0.2bar)，適合自己裝重力流常壓液相層析柱，可以根據每次實驗目標蛋 白的含量來調整純化填料的使用量和裝柱的長度，比較靈活避免浪費。不過但凡客戶問到， 我都愿意推薦 Ni-NTA Superflow。Ni-NTA Superflow 介質是高度交聯的瓊脂糖凝膠，同樣 只需一步就從澄清的細菌裂解物中純化得到帶有 HisTag 的融合蛋白，可以耐受天然或者變 性條件，包括 8M 尿素，或者 6M 鹽酸胍，還可以耐受 20mM 的巰基乙醇或者 10mM 的 DTT 等還 原劑。除此之外，Ni-NTA Superflow 可以耐受更高的壓力(140psi,10bar),流速更快(zui 大可達到 20ml/min)，可以上快速蛋白液相色譜(FPLC)，載量達到 20mg/ml。我們都知道 做蛋白純化是非常考耐性的工作， 如果是自己裝稍微長些的重力流柱， 整個純化過程無比漫 長。流出的速度過快不單影響結果，還會損害純化柱子。選擇速度、耐性和強度都更加出色 的 Ni-NTA Superflow 自然更好些。兩種填料都可以耐受很寬的 pH 范圍(pH3-12)，如果處 理時間在 2 小時內，都可以耐受 pH2-14 而保持穩定。 純化填料雖然在使用上比較靈活節約， 可以根據實驗中目標蛋白的大概含量來調整裝柱的填 料多少，不過裝柱始終是個麻煩事，速度慢不說，有氣泡、有裂縫、干柱等等意外就會前功 盡棄， 每次裝柱的差異都有可能影響結果的重復性。 散裝填料更適合那些專門做純化或者蛋 白純化經驗非常豐富的高手。Qiagen 很快意識到，對于多數實驗人員來說，更重要的是利 用*的實驗工具或者方法快速得到實驗結果，而不是反復練習實驗技能。于是，Ni-NTA Superflow 預裝柱上市了。這種預裝 1ml 或者 5ml 的柱子保留了填料的大部分優點，省掉了 自裝柱子的麻煩， zui重要的是令實驗能得到更好的重復性。 預裝柱既可以適配于多種型號的 快速蛋白液相色譜儀或者蛋白純化工作站， 也可以利用注射器進行手工操作。 優化的 Ni-NTA Superflow 預裝柱的再生非常方便， 僅需要用 NaOH 流過處理 30 分鐘即可再生使用。 離子 Ni 結合相當牢固，就算多次再生后，偶然發現純化效果下降需要用鎳離子重新螯合填料，其操 作也相當簡便。 除了 Ni-NTA 瓊脂糖、 Ni-NTA Superflow， 另外一個好用的是 Ni-NTA 離心柱 (Spin Column) 。 這個 Ni-NTA 離心柱(Spin Column)和核酸純化的小離心柱很象，不用慢慢等它一滴一滴 流， 也不要特殊的豪華儀器， 只要離心機就夠了， 真的非常方便。 每個柱子載量是 150 微克，

特別適合研究的初期階段時小量純化做快速的檢測分析。 畢竟， 要做到摸條件大規模純化蛋 白的，還遠著呢，花那工夫不如早點出結果哦。 至于 Ni-NTA 磁珠，那是為高通量快速純化多個微量樣品的機器而準備的，因為純化過程中 需要吸附、洗滌、洗脫等多個步驟，利用磁珠在磁場中的懸浮就可以很方便的進行這些步驟 而避免抽濾，減少抽濾對蛋白產物的影響。Ni-NTA 磁珠配合 Qiagen 的純化工作站，對 于是手工操作就沒有多少意義。

蛋白純化試劑盒需要有目標蛋白有親和純化標簽，例如：HIS（組氨酸標記）、GST(glutathione Stransferase )，利用親和純化介質與蛋白間的相互作用，達到了分離純化蛋白的目的。生物幫蛋白純化試劑盒產品推薦：GST標簽純化試劑盒（高通量）、組氨酸標記純化試劑盒（高通量）、組氨酸標記純化試劑盒、磷酸肽純化試劑盒、鏈霉素標簽親和純化試劑盒、T7 標簽純化試劑盒、自動蛋白質純化試劑盒（磁珠）、免疫球蛋白G純化試劑盒（蛋白A）、免疫球蛋白G純化試劑盒（蛋白G）、其他抗體純化試劑盒。