ELISA實驗前的注意事項

為了幫助您更好地解決在實驗中可能碰到的各種問題，我們設計了這些問題指導，配以試劑 盒內的說明書一起供您參考使用。如果您在實驗中遇到任何暫時無法解決的特殊問題，敬請咨詢 ，我們將熱情為您服務。很多因素都將導致免疫測定實驗的失敗，而大多數技術 失誤是可以通過全面閱讀和準確理解說明書以及實驗步驟來避免的。若對試劑盒內的說明書有任 何意見和建議，歡迎反饋。我們期待聽到您的聲音，從而完善我們的產品，更好地為您服務。

◆ 仔細閱讀說明書

◆ 檢查試劑盒標簽上的有效期。如果超過有效期，請勿使用。

◆ 按說明書確定所有試劑齊全（數量、體積）

◆ 標本制備要規(guī)范，每份標本體積要按2-3個復孔以上的量制備（貯存），盡量分裝做備份。 短期內無法實驗者，注意低溫保存

◆ 準備好所有實驗額外所需物品，（比如移液器，試管，清洗器，酶標儀）

◆ 按說明書將所用試劑平衡至室溫，根據檢測標本數量確定所需試劑的量

◆ 檢查試劑盒內每種試劑的貯存條件，保證所有試劑均按照試劑盒內說明書推薦的條件存儲。

◆ 檢查不穩(wěn)定或者變質的試劑溶液（比如沉淀或變色）。有些試劑，比如標準品稀釋液或者檢 測稀釋液，可能在設計時就含有沉淀物。所有試劑在滴入酶標板之前，必需充分混勻。而由 于沉淀物的特性，在加入酶標板之前，必需不停攪拌。

◆ 保證充分的孵育時間和溫度。

 ◆ 切勿使用不同生產批號的試劑取代現有試劑或混合現有試劑。

◆ 在混合或溶解蛋白溶液時，避免泡沫產生。

◆ 在實驗開始之前，安排好實驗流程。

◆ 在實驗開始之前，清潔工作臺。

◆ 若有問題，應與我公司或代理商的

洗板方法（Washing Techniques）

任何一個成功的ELISA檢測，正確的洗板方法是非常關鍵和重要的一方面。連貫的洗板也是 很有必要的。在稀釋濃縮洗滌液時，請使用去離子水或者蒸餾水。

◆ 洗滌瓶或多通道移液器

保證洗瓶內壓強良好或者移液器的管頭被適當調整并且無碎屑。檢查板內的板條是否安放完 好。將板條編號以防在傾泄的時候松動便于調整。首先，傾泄酶標板以清空內容物。根據試 劑盒內推薦的體積向每孔內滴加洗液。若實驗步驟中要求浸泡，則定時將每孔浸泡*。將 板內液體傾倒*，用干凈紙巾擦拭。按照說明書所示重復以上步驟。zui后一次洗板之后， 將板內液體傾倒*，用干凈紙巾拍打表面并擦干。切勿讓孔內干燥。按照試劑盒內說明書 迅速進行下一步實驗操作。

◆ 自動洗板儀

將自動洗板儀接入適當真空（根據制造商的說明）。確保每管都被適當抽吸。首先，通過抽 吸或者傾倒將板清空。根據試劑盒內推薦的體積向每孔內滴加洗液。若實驗步驟中要求浸泡， 則定時將每孔浸泡*。*抽吸各孔，保證沒有洗液殘留。在孔內液體被*抽走之后不 要再將裝置至于孔內過分抽吸。按照說明書所示重復以上步驟。zui后一次洗板之后，將板內 液體傾倒*，用干凈紙巾拍打表面并擦干。切勿讓孔內干燥。按照試劑盒內說明書迅速進 行下一步實驗操作。 

移液注意事項

◆ 反復而準確移液的關鍵是連貫的操作。流暢而迅速的移液操作是非常重要的。吸液和釋放液 體是都要避免劇烈的移動。

◆ 檢查槍頭大小是否合適，是否固定完好。

◆ 在滴加樣品或試劑時，每次更換槍頭。

◆ 請勿轉移小于移液器生產廠家推薦的zui小體積的液體。否則將會降低實驗的準確性和重復 性。

◆ 某些液體易于附著在槍頭的內外表面上，所以，預先洗滌槍頭以避免由于這種表面張力 而引起的液體體積變化。這樣會增加移液的準確性。

◆ 若果需要移動的液體是粘稠的，在吸取液體時，請在待取液體中停留一段時間，待體積達到 平衡后再移出。

◆ 用移液器吸取液體之后，用不含棉的絨紙片擦干槍頭的外表面。

◆ 在吸取液體時槍頭內如果出現氣泡，排出已吸液體并重新從容器中緩慢吸取一次。如果槍頭 內依然出現氣泡，則更換槍頭。

◆ 在吸取液體時槍頭內如果出現泡沫，則輕微傾斜移液器，并緩慢吸取液體。

◆ 每種試劑均分開配制貯存

樣本信息（Sample Information ）

我能否在實驗開始前一天收集樣品？

◆ 除非試劑盒內說明書特別說明不允許，一般都可以。

如果收集的樣品不能夠及時進行檢測， 請保存至-20℃或者按照說明書進行保存。應避免反復凍融。

◆ -20℃是推薦的冷藏保存溫度。解凍的平衡過程可能會導致樣品的降解。

我是否必需按照試劑盒內說明書中的方法準備樣品？

◆ 推薦的樣品準備方法是經過實驗驗證的好的方法，所以推薦按照說明書上的方法制備樣 品。

我能否不用推薦的收集方法來收集血漿？

◆ 每一次按照推薦步驟操作的測定都是經過驗證可行的。在某些測定中有些抗凝劑是不被推薦 的。具體請參看說明書。

 ◆ 有些待檢測的分析物也存在于血小板中，因此，推薦使用低血小板血漿。正確的收集操作方 法請參看說明書。

我能否使用自己的稀釋液或者緩沖液？

◆ 每個試劑盒中都含有按配方配制的與特異性樣品種屬相配套的稀釋液，以確保待檢測的樣品 被正確稀釋。具體請參看說明書。

建議

◆ 確定待檢測的樣品在收集和制備時保證無菌操作。

◆ 如果要檢測多個樣品，將樣品隔離并標記清楚以防相互污染。

◆ 檢測前，將樣品離心除去顆粒。將樣品轉移至新的離心管內，混合均勻。

◆ 在混合樣品時，使用容積至少比樣品體積大50%的離心管以保證混合充分。

 我沒有足量的稀釋液去稀釋所有的樣品，怎么辦？

◆ 試劑盒內提供說明書中所的足量的稀釋液。能保證所有的標準品和樣品檢測兩次。

◆ 如果沒有推薦的稀釋度，或者需要大量稀釋，請在實驗前計算出所需的稀釋液總量，然后聯 系技術服務部門獲取額外的稀釋液。

我能否使用試劑盒內非推薦的樣品類型？

◆ 試劑盒內說明書中所的樣品類型是經過驗證可行的。其它未推薦的樣品類型是沒有經過 任何檢測的。

我使用對照的檢測結果都在范圍外，為什么？

◆ 如果使用對照，其濃度應該是在某一特定范圍內。如果對照值在范圍外，則是無效測定。

◆ 確定對照具有重復性。

我是否可以將試劑盒中說明書的樣品數據作為參考？

◆ 說明書中的樣品數據是從有限的檢測個體中得出，只能作為大概的指導。

 我是否可以省略說明書中標準曲線的標準品值？

 ◆ 不可以。樣品值必需由每次檢測的標準曲線決定。

如果是手繪標準曲線，我怎樣決定樣品濃度？

◆ 要決定每個樣品的濃度，首先找到Y軸的光度值或者相對光單位，然后作水平線至標準曲線。 在交點處，作垂線至X軸，讀取相應濃度。

我怎樣補償樣品的稀釋度或者濃縮度？

◆ 如果樣品是稀釋型的，標準曲線所讀取的值必需乘以稀釋度。

◆ 如果樣品是濃縮型的，標準曲線所讀取的值必需除以濃縮比。

我怎樣將樣品值的單位轉換成Units？

 ◆ 如果可以使用NIBSC/WHO標準，可使用說明書中介紹的相應的轉換方程進行轉換。插入你的樣品值到方程中將pg/mL 或者ng/mL轉換成Units。

我檢測到的樣品值在測定實驗的動態(tài)范圍之外，我是否可以用這些數值？

◆ 只有隨標準曲線降低的樣品值才被推薦使用。在標準曲線范圍外的值都是非線性的，會導致 錯誤的外推值。

◆ 如果測定的樣品值比zui高的標準品的值還要高，則此樣品需要進一步的稀釋并重新進行檢 測。

◆ 如果測定的樣品值遠低于測定范圍，則樣品被認為是無法被檢測。

我的標準曲線看上去還不錯，但是卻沒有達到我預期的結果，為什么？

◆ 樣品可能不含有待分析物。

◆ 稀釋液的影響可能遮蔽了檢測。確保采用說明書推薦的稀釋度。

◆ 如果確實采用的是推薦的稀釋度，則檢查稀釋操作是否正確。過度稀釋將導致樣品值低于標 準曲線范圍。

度/重復性（Precision/Reproducibility）

免疫測定的性可由酶標板孔之間的重復性和每次檢測之間的重復性決定。由高CV值引起的 低度一般由兩個因素引起：移液操作和洗液操作。

我需要在孔內混合試劑嗎？

◆ 當多種試劑滴加至一個孔內時（比如稀釋液和樣品），需要在孔內進行混合。滴加試劑和樣 品至每孔的中心，輕拍酶標板使其充分混合。

我的試劑/樣品是粘稠狀的，不易于吸取移動，怎么辦？

◆ 在吸取粘稠液體時，請在待取液體中停留一段時間，待體積達到平衡后再移出。

◆ 用相應試劑預洗滌槍頭以補償液體的表面張力。 微量移液器

◆ 槍頭中的液體體積不足或者不均勻，表明移液器需要被校準。檢查移液器的功能，必要時重 新校準。

◆ 在滴加試劑，標準品，樣品時應及時更換槍頭以避免互相污染。

◆ 檢查槍頭是否安裝完好。如果安裝不得當，可能會導致吸液和排出液體是體積不準確。

◆ 從容器中移出槍頭時，將槍頭輕靠在受液容器壁上移去殘留在槍頭外表面的液體。

正確洗板方法

◆ 如果使用自動洗板儀，抽吸裝置或者多道移液器。確保每管都被適當抽吸。在孔內液體被完 全抽走之后不要再將裝置至于孔內過分抽吸。按照說明書所示重復以上步驟。zui后一次洗板 之后，將板內液體傾倒*，用干凈紙巾拍打表面并擦干。

◆ 洗板太快或者太慢，不*洗板或者抽吸。

◆ 孔內干燥等各種因素都將影響檢測結果的準確性。按照試劑盒內說明書迅速進行下一步實驗 操作。

我是否可以使用同一容器盛放所有的試劑？

◆ 不可以。請使用不同的容器盛放不同的試劑以避免污染。

◆ 有些待分析物對污染極其敏感（比如唾液，氧化試劑等等）。根據說明書，注意預防試劑盒 內試劑污染。

我可以重復使用蓋板嗎？

◆ 再利用的蓋板上可能含有上一步驟的殘留物，可能會污染孔內現有的成分從而導致性降 低。所以在每次孵育的時候使用新的蓋板。很多因素都能影響標準曲線的結果，其中就包括 制備和操作。 標準曲線（Standard Curve） 很多因素都能影響標準曲線的結果，其中就包括配制和操作。

我是否可以改變標準品的配制？

◆ 不可以。用的稀釋液適當稀釋的重組標準品如說明書中所示。

◆ 混合和溶解標準品時，應避免起泡。

◆ 溶解后的標準品靜置至少15分鐘（根據說明書）。在使用之前輕輕混勻，保證所有的 固體已經溶解。

◆ 制作標準曲線時，確保所有的稀釋步驟已經準確完成。稀釋時注意及時更換槍頭。在移液之前將稀釋液充分混合。

洗滌方式怎樣影響我的標準曲線？

◆ 不*的洗滌會降低測定性，導致不理想的標準曲線結果。確保洗板機的正常工作，確 保酶標板各孔被充分洗滌卻不干燥。

移液方式怎樣影響我的標準曲線？

◆ 不合理的移液操作會導致高CV值和不理想曲線。

◆ 在制作標準曲線的過程中，不正確的移液方式會導致錯誤的稀釋，從而使錯誤的數值進入標 準曲線中，或者產生非線性曲線。確保移液器正常工作。每孔中的液體體積不等可能就是移 液器失靈或者槍頭使用不當所致。

我的電腦軟件不支持推薦的數據歸納方式，我是否可以用其它的？

◆ 可以，然而，每次測定使用說明書中推薦的數據歸納方式。使用不同的數據歸納方式會 導致結果的浮動。

◆ 對于不同的計算機軟件，將標準品的吸光度設定為Y軸，濃度設定為X軸。用對數紙作出的 數據應該是線性的，回歸分析被應用于對數變換。如果不能使用對數紙，則將濃度的對數和 OD值的對數進行線性作圖。zui適曲線由回歸分析決定。

測定多個酶標板時是否可以使用同一條標準曲線？

◆ 在測定不同板中的樣品時，每一個板都對應一條標準曲線。技術錯誤或者不同的孵育情況， 環(huán)境條件都會引起酶標板之間產生不同結果。一條標準曲線測定的樣品值必需是在相同環(huán)境 下產生的，否則就是無效值。

我的標準曲線是平的或者是非線性的，這可能是由于什么原因引起的？

引起不理想的標準曲線的原因有很多，zui常見的原因例舉如下：

◆ 確定稀釋是否得當。

◆ 確定波長是否正確。

◆ 標準品和樣品必需在15-20分鐘內滴加入板內。（除非試劑盒內說明書特別說明）

◆ 檢查背景是否過高。

◆ 確定酶標板是否正確洗滌。不恰當的洗滌可能會引起具有高背景的平直曲線。

◆ 在測定過程中重復讀板。在超過建議時間后讀板會導致錯誤的結果。

◆ 如果zui高的標準品的讀數超過了酶標儀的范圍，確定標準品是否正確溶解，孵育時間和溫度 是否準確。

◆ 為保證實驗準確性請重復測定。

◆ 如果使用對照，對照的濃度必須在測定范圍內。

◆ 在檢測和孵育過程中確定試劑沒有被污染。

◆ 沒有任何信號的平直標準曲線可能是由于酶結合物或者底物沒有反應。檢查各個操作過程

◆ 由于許多酶標儀的限制，因此建議標準品檢測由高向低做復孔。

邊緣效應（Edge Effect）

邊緣效應的定義是酶標板孔內中心部分與酶標板孔內遠離中心部分之間相比存在明顯的信號差 異，一般歸因于兩個主要因素。

孵育環(huán)境確實對實驗有影響嗎？

◆ 是的。孵育時溫度不均會引起邊緣效應。請嚴格按照推薦的溫度進行孵育。如果條件允許， 可以在能夠控溫的孵育器中進行孵育。

◆ 在使用之前將所有試劑平衡至室溫。（除非特別說明）

◆ 在實驗開始之前檢查工作的環(huán)境溫度。如果曲線很平直，可能是由于工作環(huán)境溫度低于氣溫所致。

在孵育末期我注意到蓋板一側突起來了，這是否會影響我的實驗結果？

◆ 蓋板如果使用不恰當會導致邊緣效應。

跳孔（Drift）

跳孔的定義是酶標板從左側到右側的孔或從上到下的孔內信號出現顯著的倒置現象

我剛配置試劑的時候中斷了，這是否會影響我的實驗結果？

◆ 這可能會導致產生波動的曲線。在移液之前確定所有的標準品或者樣品是否配制完好。請在 試劑配制完的15-20分鐘內滴加入板內。（除非特別說明）

我是否需要一個多道移液器？

◆ 在配制諸如底物，酶結合物，或者稀釋液的時候，選擇連續(xù)或多道移液器。

如果我沒有平衡試劑會怎樣？

◆ 沒有平衡的試劑會導致孔之間溫度不均，使整個酶標板的信號產生變異。除非特別說明，試 劑一般在使用之前都要平衡至室溫。

◆ 每次檢測都會有推薦的孵育時間和溫度。冷凍的試劑一般需要更長的孵育時間。所以使 用說明書上推薦的孵育溫度和時間。

我是否需要蓋板？

◆ 參看試劑盒內說明書。如果說明書內的實驗步驟中有推薦使用蓋板，則在使用時應選用與酶 標板配套的蓋板，使邊緣與酶標板緊密契合。如果蓋板的一邊突起，則會產生信號的差別。

酶標儀的設置怎樣影響我的結果？

◆ 對于底物測定，如果讀數時間等于或超過2秒/孔，使從*孔到zui后一孔在讀書時存在時間 上的延誤，會導致結果的異變。在底物反應階段，辣根過氧化物酶會一直作用直到底物反應 *。而由于時間的延誤，底物越來越少，底物反應也受到影響。將酶標儀的讀數時間設定 為1.0秒/孔。

我是否可以根據自己的方案來調整孵育時間？

◆ 更改孵育時間或溫度會導致檢測不能達到平衡或過度反應。請按照說明書推薦的孵育時間和 溫度操作。

◆ 如果同時進行多項檢測，對每孔必需分別計時已避免孵育不足或過度孵育。 信號變化（Signal Development） 信號的變化受以下幾個因素影響：底物，孵育時間，酶結合物和底物反應失敗，波長和儀器。

我是否可以更改底物處理的方法？

◆ 如果反應物溶液需要混合，確保加入的反應物試劑體積正確并充分混合。混合后的溶液必需 在15分鐘內使用（化學發(fā)光檢測zui多4小時）。如果反應物混合得太早，則在容器中的顏色 可能會發(fā)生變化。

◆ 如果底物是凍干品或片劑，則根據說明書中的方法用適當體積的稀釋液將其*溶解。混合 *后并在說明書中推薦的時間內使用。

我在移液的時候是否要按照一定的順序？

◆ 根據說明書中的順序進行移液操作。

◆ 高靈敏度檢測利用了放大系統(tǒng)。在底物孵育完成之后，按照加底物的順序依次加入放大試劑。

◆ 底物加完之后，輕拍酶標板使其充分混合。

底物有可能被污染嗎？

◆ 是的。如果測定時使用的是堿性磷酸酶或者辣根過氧化物酶標記的結合物，在測定時要注意 避免污染。污染可能會導致產生超過酶標儀范圍的值。避免與金屬或氧化試劑接觸。使用新容器。

底物是否需要在黑暗環(huán)境中進行孵育？

◆ 不需要。不過在孵育過程中應避免陽光直射。

溫度怎樣影響結果？

◆ 堿性磷酸酶或者辣根過氧化物酶都是光敏感型酶。光密度單位或者相對光單位都會隨著溫度 的改變而變化。

◆ 避免在環(huán)境條件變化劇烈的地方孵育。（比如通風口，窗口這些溫度和光照都劇烈變化的地 方） 為了保證酶結合物和底物反應*：

◆ 對于比色法測定： 將同體積的結合物和底物溶液充分混合（對于高靈敏度的試劑盒，在加入同體積的結合物和 底物一分鐘之后，再加入等體積的擴增劑）。顏色若不是立即顯現，則檢查所加成分是否在 正確的貯藏溫度下保存，是否被污染，是否在有效期內。

我是否需要校正波長？

◆ 對于比色法測定，需要通過校正波長來減少誤差。

如果我沒有校正波長應該怎么辦？

◆ 將所讀波長減去原始校正波長。這個方法可以更正光學誤差。

我的酶標儀上沒有說明上推薦的那種用來校正波長的濾光片，我可以用別的嗎？

◆ 可以。只要選擇的波長高于推薦的校正波長即可。

我的酶標儀沒有說明書上推薦的波長，我可以用別的嗎？

◆ 推薦波長由使用的底物和反應后顏色的峰吸收度決定。說明書上一般都有相應數據，如果沒有，則選擇zui接近的波長。不過，這種數據變化比較大。

為什么我的相對光單位與說明書上的不一致？

◆ 由于工業(yè)上對于光單位的衡量沒有統(tǒng)一的標準，所以相對光單位在酶標儀之間的變化非常 大。相對光單位的數值應該具有可比性。

◆ 使用推薦的酶標儀設置，如果使用不同的酶標儀則進行相應的等值設置。不同的設置會產生 不同的信號。

◆ 在讀數窗口準確讀數。

我是按照實驗步驟進行測定的，但是沒有任何信號，為什么？

◆ 對于使用HRP底物的比色測定，終止液的加入會使底物變色。而說明書推薦的波長就是zui 適波長。

◆ 通過輕拍酶標板的邊緣充分混合孔內試劑。加入終止液的時，顏色由藍變黃（如果是HRP 底物）。如果加終止液之前孔內試劑沒有混合，則底物顏色變綠。

◆ 可能加入試劑的順序錯誤。

◆ 加入底物溶液以后不要清洗酶標板。

◆ 在連續(xù)稀釋時確定已經加入標準品。

◆ 如果底物系統(tǒng)中有兩個成分，則必需混合均勻。

◆ 確定酶標儀的使用和操作正確。

◆ 確定試劑，標準品，樣品都正確配制并按照說明滴加無誤。

◆ 對于高敏感性試劑盒，確定使用的底物和放大劑都正確稀釋。

引起高背景的原因有哪些？

◆ 孵育時間和溫度的改變。

◆ 不恰當的洗滌。

◆ 試劑被污染。

◆ 孵育時酶標板被污染。

◆ 蓋板，容器或者槍頭的重復使用

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